內(nèi)毒素誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加及微管解聚的機(jī)制研究.pdf

1、目的:1、探討GEF-H1/RhoA信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加中的作用;
　　2、探討LPS引起血管內(nèi)皮細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)變化及其可能機(jī)制。
　　方法:1、采用小干擾(siRNA)技術(shù)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)GEF-H1表達(dá)，蛋白免疫印跡技(Westernblot)檢測(cè)LPS引起的細(xì)胞內(nèi)GEF-H1表達(dá)及RhoA/ROCK信號(hào)通路底物蛋白MYPT1磷酸化;
　　2、通過(guò)siRNA抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞GEF-H1表達(dá)或采

2、用Y27632抑制ROCK活性，酶標(biāo)儀測(cè)定LPS引起Transwell下室中伊文思藍(lán)標(biāo)志血清(Evansbluedye-labeledalbumin，EB-Albumin)OD值變化;熒光染色觀察LPS引起血管內(nèi)皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重構(gòu);Westernblot檢測(cè)LPS引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞MLC和MYPT1磷酸化及細(xì)胞間緊密連接蛋白（occludin和claudin-1）和粘附連接蛋白(VE-cadherin)丟失;
　　3、West

3、ernblot檢測(cè)LPS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞微管蛋白水平和微管相關(guān)蛋白4（microtubuleassociatedprotein4，MAP4）磷酸化的影響;雙熒光染色觀察微管蛋白和乙酰化微管蛋白(acetylated-alpha-tubulin,Acet-tubulin)分布及表達(dá)水平。采用p38/MAPK特異性抑制劑SB203580阻斷p38/MAPK通路，Westernblot檢測(cè)LPS誘導(dǎo)的MAP4磷酸化和Acet-tubulin蛋白

4、的變化;同時(shí)采用激光共聚焦觀察LPS誘導(dǎo)的微管變化。
　　結(jié)果:1、LPS引起Transwell下室中EB-AlbuminOD值增加，沉默血管內(nèi)皮細(xì)胞GEF-H1或采用Y27632阻斷ROCK通路都可以顯著降低由LPS刺激引起的EB-albuminOD值增加(P＜0.05);
　　2、GEF-H1表達(dá)和MYPT1磷酸化都呈LPS劑量依賴性變化，兩者趨勢(shì)一致;siRNA沉默內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)GEF-H1或采用Y27632預(yù)處理細(xì)胞都可

5、以明顯抑制由LPS刺激引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)MLC和MYPT1磷酸化水平，減輕由LPS導(dǎo)致的緊密連接蛋白和粘附連接蛋白丟失(P＜0.05);
　　3、熒光染色顯示，LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力纖維形成明顯增多;沉默血管內(nèi)皮細(xì)胞GEF-H1或用Y27632預(yù)處理細(xì)胞都可以明顯減輕由LPS引起的胞內(nèi)應(yīng)力纖維形成;
　　4、LPS能夠引起血管內(nèi)皮細(xì)胞微管蛋白去乙?；黾?，胞內(nèi)聚合態(tài)微管蛋白減少，MAP4磷酸化水平增加;SB203

6、580阻斷p38/MAPK信號(hào)通路能夠有效減輕LPS導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)微管蛋白去乙酰化和MAP4磷酸化。熒光雙染色顯示，LPS導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞微管出現(xiàn)斷裂，失去網(wǎng)格狀形態(tài)，呈稀疏模糊和粉塵顆粒狀，Acet-tubulin熒光強(qiáng)度減弱。SB203580阻斷p38/MAPK信號(hào)通路后可以減輕LPS引起的上述變化。
　　結(jié)論:1、GEF-H1/RhoA信號(hào)通路介導(dǎo)LPS引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞高通透性改變;
　　2、LPS活化p38/MAPK