化濁解毒方對慢性萎縮性胃炎大鼠Hippo-YAP信號通路及相關(guān)蛋白的影響.pdf

1、目的：慢性萎縮性胃炎（CAG）屬于胃癌前疾病，尤其是伴有腸上皮化生、異型增生等胃癌前狀態(tài)者，癌變可能性更大，其發(fā)生癌變與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。Hippo/YAP信號通路及其相關(guān)蛋白對細(xì)胞增殖有調(diào)控作用，作為胃癌發(fā)病及治療的新靶點，日益受到關(guān)注?；瘽峤舛痉皆谥委烠AG的長期臨床應(yīng)用中，也取得了顯著的療效。本研究通過觀察化濁解毒方對CAG大鼠模型的一般情況、胃黏膜組織病理學(xué)改變、胃黏膜組織中Hippo/YAP信號通路的主要成分YAP、TEAD以

2、及與其調(diào)節(jié)相關(guān)的上游Merlin蛋白、下游Survivin蛋白表達(dá)水平的變化，探討化濁解毒方治療CAG的作用機(jī)制，為濁毒理論治療CAG的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　方法：將70只體重在250-300g健康清潔級雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用隨機(jī)數(shù)字表法抽取12只作為正常組（N），剩余58只作為模型組（Model Group, M），采用N-甲基-N'-硝基-亞硝基胍（MNNG）自由飲用，雷尼替丁灌胃，結(jié)合饑飽失常聯(lián)合造模法建立C

3、AG大鼠模型。造模20周后，N組和M組均隨機(jī)抽取2只觀察造模效果，確認(rèn)模型復(fù)制成功后，按照隨機(jī)原則將模型組分為5組：自然恢復(fù)組（SR）、維酶素組（VG）、化濁解毒方高劑量組（HG）、化濁解毒方中劑量組（MG）、化濁解毒方低劑量組（LG），各10只（造模過程中有6只大鼠死亡）。從造模成功后的第2天開始，N組、SR組給予10ml/kg/d蒸餾水灌胃，VG組給予10ml/kg/d維酶素混懸溶液灌胃，生藥量為0.006g/ml，HG、MG、LG

4、組給予10ml/kg/d化濁解毒方中藥懸濁液灌胃，生藥量分別為2.8g/ml、1.4g/ml、0.7g/ml，灌胃期間觀察大鼠體重、毛發(fā)色澤、齒爪色澤、精神狀態(tài)、食欲狀態(tài)、大便情況等一般情況的變化，共灌胃治療12周。末次給藥后禁食、禁水48h，麻醉后取病變明顯處胃黏膜組織并處死。采用HE染色方法觀察胃黏膜組織病理學(xué)改變，免疫組織化學(xué)（SP法）、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、蛋白質(zhì)印記法（Western Blot）檢測胃黏膜中Hi

5、ppo/YAP的YAP、TEAD及上游Merlin、下游Survivin的基因和蛋白表達(dá)水平。使用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.一般情況:造模階段，N組大鼠的一般狀態(tài)與實驗前無異。M組大鼠造模后一般狀態(tài)發(fā)生改變，其毛色晦暗無光澤，脫毛嚴(yán)重，精神萎靡，反應(yīng)遲緩，活動量少，喜扎堆，嗜蜷臥，食量減少，體重明顯下降，糞便質(zhì)軟或不成形。治療階段，經(jīng)藥物灌胃治療后，VG組、HG組、MG和LG組大鼠的

6、一般情況均有改善，其中HG組大鼠的一般情況有明顯好轉(zhuǎn)，VG組、MG組大鼠的一般情況也有好轉(zhuǎn)，LG組、SR組大鼠的一般情況改善不明顯。
　　2.胃黏膜組織病理學(xué)觀察。肉眼觀察：造模階段，N組大鼠的胃黏膜組織表面光滑，呈粉紅色，黏膜皺襞排列整齊；M組大鼠的胃黏膜組織表面粗糙，部分存在顆粒狀隆起，呈灰白色，可見大量點片狀紅斑及出血點，少數(shù)出現(xiàn)糜爛，黏膜皺襞低平、稀少或走向紊亂，部分甚至消失。治療階段，HG組、MG組、VG組大鼠的胃黏膜病

7、變有明顯改善；LG組、SR組大鼠的胃黏膜病變部分改善。組織病理學(xué)觀察：造模階段，N組黏膜層厚度正常，上皮細(xì)胞完整，固有腺體數(shù)量適中、排列整齊，無炎性細(xì)胞浸潤；M組黏膜層變薄，上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，固有腺體減少，排列紊亂，黏膜肌層變厚，間質(zhì)存在炎性細(xì)胞浸潤。治療階段，HG組、MG組、VG組大鼠黏膜厚度適中，上皮細(xì)胞無明顯的變性壞死，固有腺體數(shù)量適中，排列較整齊，間質(zhì)存在少量炎性細(xì)胞浸潤；LG組、SR組黏膜也有部分改善。
　　3.

8、胃黏膜中Hippo/YAP信號通路及相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較
　　3.1胃黏膜中Hippo/YAP信號通路表達(dá)水平比較
　　3.1.1胃黏膜中YAP的表達(dá)水平比較:SR組YAP的光密度平均值、最后灰度值和mRNA均高于N組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，且均高于HG組、MG組、LG組和VG組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；不同劑量中藥組的光密度平均值、最后灰度值和mRNA隨中藥劑量的升高而降低，HG組低于MG組、LG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，MG組低于

9、LG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；西藥治療組和中藥組比較，HG組的光密度平均值、最后灰度值和mRNA低于VG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，MG組與VG組的光密度平均值、最后灰度值和mRNA相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；N組的光密度平均值、最后灰度值和mRNA均為最低，低于VG組、MG組、LG組比較有顯著差異，N組的光密度平均值低于HG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，N組的最后灰度值和m RNA與HG組相近，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.1.2胃黏膜中TEAD的表

10、達(dá)水平比較:SR組TEAD的光密度平均值、最后灰度值和mRNA均高于N組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，且均高于HG組、MG組和VG組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，SR組的光密度平均值、最后灰度值和mRNA與LG組相近，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義；不同劑量中藥組的光密度平均值、最后灰度值和mRNA隨中藥劑量的升高而降低，HG組低于MG組、LG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，MG組低于LG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；西藥治療組和中藥組比較，VG組的光密度平均值、最后灰度值和mRN

11、A表達(dá)高于HG組、MG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；N組的光密度平均值、最后灰度值和mRNA均為最低，低于VG組、MG組、LG組比較有顯著差異， N組的光密度平均值低于HG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，N組的mRNA和最后灰度值與HG組相近，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.2胃黏膜中Hippo/YAP信號通路上游調(diào)節(jié)蛋白Merlin的表達(dá)水平比較:SR組Merlin的光密度平均值、最后灰度值和mRNA均低于N組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，且均低于HG組、

12、MG組、LG組和VG組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；不同劑量中藥組的光密度平均值、最后灰度值和mRNA隨中藥劑量的升高而增高，HG組高于MG組、LG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，LG組與MG組蛋白的光密度平均值、最后灰度值和mRNA相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；西藥治療組和中藥組比較，HG組的光密度平均值、最后灰度值和mRNA高于VG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；N組的光密度平均值、最后灰度值和mRNA最高，高于VG組、HG組、MG組、LG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

13、r>　　3.3胃黏膜中Hippo/YAP信號通路下游調(diào)節(jié)蛋白Survivin的表達(dá)水平比較:SR組Survivin的光密度平均值、最后灰度值和mRNA均高于N組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，且均高于HG組和VG組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，SR組與LG組、MG組蛋白的光密度平均值、最后灰度值和mRNA相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；不同劑量中藥組的光密度平均值、最后灰度值和mRNA隨中藥劑量的升高而降低， HG組低于MG組、LG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；西藥治療

14、組和中藥組比較，VG組的光密度平均值、最后灰度值和mRNA低于HG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；N組蛋白的光密度平均值、最后灰度值和mRNA均為最低，低于VG組、HG組、MG組、LG組比較有顯著差異。
　　結(jié)論：
　　1.化濁解毒方能夠改善CAG大鼠的一般情況，修復(fù)受損的胃黏膜。
　　2.CAG大鼠的胃黏膜組織中YAP、TEAD及Survivin的表達(dá)水平升高，Merlin表達(dá)缺失。
　　3.化濁解毒方能顯著改善CAG大