牡蠣皰疹病毒魁蚶株交叉引物等溫?cái)U(kuò)增檢測方法的建立及貝類派琴蟲流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、牡蠣皰疹病毒魁蚶株（SB strain of Ostreid herpesvirus-1，OsHV-1-SB）是由2012年6月本實(shí)驗(yàn)室從山東長島、萊州、日照和即墨等地的養(yǎng)殖基地魁蚶樣品中檢測獲得，其感染健康魁蚶后，主要表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、觸碰后雙殼不閉合或閉合緩慢，外套膜內(nèi)縮，內(nèi)臟團(tuán)呈灰白色或黑灰色。出現(xiàn)上述癥狀的個(gè)體一般1d內(nèi)就會(huì)死亡，其死亡率可達(dá)到75％，目前關(guān)于該病毒的有效檢測方法尚未建立。本論文根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已測序完成的OsHV-1

2、-SB全基因組序列，運(yùn)用交叉引物等溫?cái)U(kuò)增（cross priming amplification，CPA）技術(shù)，通過對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化、CPA產(chǎn)物的酶切鑒定、CPA靈敏度實(shí)驗(yàn)、CPA特異性實(shí)驗(yàn)和實(shí)際樣品的檢測，為OsHV-1-SB建立了一種現(xiàn)場簡單、快速、高靈敏度的檢測方法。同時(shí)，運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)對(duì)2010年全年實(shí)驗(yàn)室采集貝類樣品中派琴蟲感染情況進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，以期為

3、派琴蟲的有效防控提供一定的理論依據(jù)。研究方法和部分結(jié)果如下：
　　第一部分：根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已測序完成的OsHV-1-SB全基因組序列（文未發(fā)），選擇其保守區(qū)域作為CPA反應(yīng)的靶序列，使用PrimerExplorer4.0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)出一套CPA反應(yīng)引物，并對(duì)反應(yīng)體系的溫度、dNTPs和Mg2+濃度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，最佳溫度為63℃，反應(yīng)時(shí)間為60min，dNTPs濃度為1.4mmol/L，Mg2+濃度為6mmol

4、/L。該方法檢測靈敏度為30拷貝的質(zhì)粒DNA，并且特異性較強(qiáng)，與貝類常見病原急性病毒性壞死病毒、鮑魚皰疹病毒、派琴蟲、包納米蟲、馬爾泰蟲以及對(duì)蝦白斑綜合征病毒和副溶血弧菌均無交叉反應(yīng)。并使用實(shí)驗(yàn)建立的CPA檢測方法對(duì)2012年分別采自韓國慶尚南道、山東長島、遼寧大連共計(jì)22份OsHV-1-SB感染情況未知的魁蚶樣品進(jìn)行了檢測。研究表明，實(shí)驗(yàn)所建立的OsHV-1-SB的CPA檢測方法簡單、快速、靈敏且特異性強(qiáng)。由于其檢測結(jié)果可通過簡單離心

5、觀察白色沉淀或者向反應(yīng)管中加入核酸熒光染料GeneFinderTM通過顏色變化進(jìn)行陰陽性判斷，所以可以在沿海條件簡陋的貝類養(yǎng)殖廠及實(shí)驗(yàn)室使用，具有較好的應(yīng)用前景。
　　第二部分：派琴蟲是危害貝類養(yǎng)殖業(yè)的主要寄生蟲，實(shí)驗(yàn)通過對(duì)2010年全年采自山東青島、山東榮成、山東長島、廣東惠安和福建霞浦的共計(jì)548份貝類樣品，提取核酸后使用OIE推薦的PCR檢測方法對(duì)派琴蟲進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，全部樣品中奧爾森派琴蟲的陽性率達(dá)到了21.17%，

6、其中青島流清河貝類樣品中櫛孔扇貝（蓬萊紅和野生苗）陽性率為22.00%，貽貝陽性率為55.00%；榮成桑溝灣櫛孔扇貝（蓬萊紅、野生苗和人工苗）陽性率為16.30%，貽貝陽性率為18.52%；煙臺(tái)長島縣貝類樣品陽性率較低，只有皺紋盤鮑檢測到陽性，櫛孔扇貝野生苗和蝦夷扇貝中均沒有檢測到奧爾森派琴蟲。同時(shí)，對(duì)各月份采集貝類樣品奧爾森派琴蟲的整體陽性比率進(jìn)行匯總分析，結(jié)果顯示，奧爾森派琴蟲感染主要發(fā)生在夏季水溫較高季節(jié)，其中在7月達(dá)到了峰值。而

7、在1、2、12月水溫較低時(shí)期，未檢測到奧爾森派琴蟲感染陽性樣品。
　　第三部分：急性病毒性壞死病毒（AVNV）是阻礙櫛孔扇貝養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要病原，本文根據(jù)已完成的AVNV全基因組序列，通過PCR技術(shù)得到編碼AVNV多重跨膜蛋白的ORF110基因，并進(jìn)行了TA克隆得到pMD18-T-110質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶SnaBⅠ和NotⅠ雙酶切后和真核表達(dá)載體pPIC9K連接、轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建得到用于蛋白表達(dá)的重組質(zhì)粒