抗氧化防御蛋白MT抗DOX心肌細(xì)胞毒性的作用機(jī)制.pdf

1、阿霉素(doxorubicin，DOX)屬蒽配類抗生素，作為一種高效抗腫瘤藥物廣泛應(yīng)用于臨床治療白血病、乳腺癌等。然而在用藥過程中，DOX嚴(yán)重的心臟毒性限制了它的臨床應(yīng)用。研究表明，DOX的心臟毒性主要與其體內(nèi)代謝過程中活性氧(reactiveoxygen species，ROS)的大量生成有關(guān)，過量的ROS攻擊心肌細(xì)胞，從而引起心臟的氧化損傷。金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的低分子量、富含巰基

2、的金屬結(jié)合蛋白。M工具有多種生物學(xué)效應(yīng)，其消除自由基和抗氧化的功能尤其引人關(guān)注。我們前期的體內(nèi)研究利用 MT-Ⅰ/Ⅱ型基因敲除(MT-/-)和野生型(MT+/+)小鼠研究MT不同表達(dá)水平對(duì)DOX心臟毒性損傷的影響。結(jié)果顯示，MT-/-小鼠由于MT基因的缺失對(duì)DOX誘發(fā)的心臟毒性更加敏感，由此說明MT在對(duì)DOX心臟毒性的保護(hù)效應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究采用MT+/+和MT-/-乳鼠的心肌組織分別構(gòu)建體外細(xì)胞培養(yǎng)模

3、型，觀察DOX對(duì)這兩種小鼠心肌細(xì)胞的毒性作用，并且從氧化損傷角度探討MT對(duì)DOX致培養(yǎng)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制。
　　 應(yīng)用鎘-血紅素飽和法檢測(cè)兩種小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)MT的含量，結(jié)果顯示MT+/+小鼠心肌細(xì)胞中MT含量約為MT-/-小鼠的2.5倍，由此驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃?。?yīng)用不同濃度DOX對(duì)MT++和MT-/-小鼠心肌細(xì)胞分別進(jìn)行染毒，脫察細(xì)胞形態(tài)變化，檢測(cè)心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH

4、)漏出、細(xì)胞存活率、細(xì)胞搏動(dòng)頻率以及細(xì)胞凋亡率，評(píng)價(jià)MT對(duì)DOX所致心肌細(xì)胞毒性的影響。結(jié)果顯示，DOX能夠產(chǎn)生明顯的心肌細(xì)胞毒性，劑量依賴性地引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、增加LDH漏出和細(xì)胞凋亡率、降低細(xì)胞存活率和搏動(dòng)頻率。MT--小鼠心肌細(xì)胞的損傷程度要明顯高于MT+/+小鼠，該結(jié)果表明MT的缺失使心肌細(xì)胞對(duì)DOX的毒性作用更為敏感，由此可見MT在對(duì)DOX心肌細(xì)胞毒性的保護(hù)效應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。
　　 大量研究表明DOX的心臟毒性主

5、要與ROS有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了DOX對(duì)MT+/+和MT-/-小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成以及各種抗氧化酶活力的影響，以此來評(píng)價(jià)MT對(duì)DOX所致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用。結(jié)果顯示，DOX能劑量和時(shí)間依賴性地增加心肌細(xì)胞岡ROS的生成，降低抗氧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)的活性，并且這一作用在MT-/-小鼠心肌細(xì)胞更為顯著。該結(jié)果表明，MT的缺失使得心肌細(xì)胞對(duì)DO

6、X所致的氧化應(yīng)激更為敏感，MT對(duì)DOX心肌細(xì)胞毒性的保護(hù)作用可能與其抗氧化損傷有關(guān)。
　　 細(xì)胞內(nèi)過量產(chǎn)生的ROS能攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及DNA等生物大分子，從而造成心肌細(xì)胞氧化損傷。采用TBA顯色法、單細(xì)胞凝膠電泳法(彗星試驗(yàn))和8-OHdG免疫組化法、DNPH比色法分別檢測(cè)了DOX對(duì)MT+/+和MT-/-小鼠心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化、DNA損傷以及蛋白質(zhì)羰基化的影響，以此評(píng)價(jià)MT對(duì)DOX所致心肌細(xì)胞氧化損傷的影響。結(jié)果顯示，DOX能

7、引起明顯的心肌細(xì)胞氧化損傷，表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(thiobarbituric acid reactive substance，TBARS)生成的增多、DNA斷裂及8-OHdG生成的增多，以及蛋白羰基含量增多。同樣地，MT-/-小鼠心肌細(xì)胞的氧化損傷程度更為顯著。結(jié)果表明，MT對(duì)DOX心肌細(xì)胞毒性的保護(hù)作用可能與其降低心肌細(xì)胞氧化損傷程度有關(guān)。外源性抗氧化劑NAC和還原型谷胱甘肽(reduced glutathion

8、e，GSH)能夠完全抑制DOX引起的MT+/+小鼠心肌細(xì)胞存活率降低、ROS生成增加以及抗氧化酶活性降低，使上述指標(biāo)恢復(fù)甚至超過正常水平。然而對(duì)于MT-/-小鼠心肌細(xì)胞，NAC和GSH僅能起到部分抑制的作用。該結(jié)果進(jìn)一步表明基礎(chǔ)水平的MT對(duì)DOX所致的心肌細(xì)胞氧化損傷具有重要的保護(hù)效應(yīng)。
　　 目前認(rèn)為，線粒體功能紊亂在多種心臟疾病中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從線粒體氧化損傷的角度進(jìn)行了研究。利用MitoSox Red和

9、Rhodamine123熒光探針，分別檢測(cè)了DOX對(duì)MT+/+和MT-/-小鼠心肌細(xì)胞線粒體超氧陰離子(O2·-)和線粒體膜電位(△Ψ)的影響，評(píng)價(jià)MT對(duì)DOX所致心肌細(xì)胞線粒體氧化損傷的作用。結(jié)果顯示，DOX能引起明顯的心肌細(xì)胞線粒體損傷，表現(xiàn)為線粒體O2·-生成增多和線粒體△Ψ降低，并且MT-/-小鼠心肌細(xì)胞的線粒體損傷程度更為顯著。此外，還發(fā)現(xiàn)NAC和GSH對(duì)DOX引起的MT++小鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷也能夠起到完全抑制的作用，而對(duì)