銀耳多糖抗心肌細胞凋亡作用的實驗研究.pdf

1、目的： 1、從細胞及動物整體水平研究銀耳多糖抗心肌細胞凋亡的作用。 2、研究銀耳多糖抗心肌細胞凋亡的最佳作用劑量。 3、為銀耳多糖抗衰老的臨床應用提供實驗依據(jù)。 方法： 1、銀耳多糖粗品的精制與鑒定銀耳烘干及碾磨后，將去除了部分雜蛋白、色素、脂肪類物質的銀耳粉溶解離心后，獲得銀耳多糖的浸提液。將得到的銀耳粗多糖加水溶解成接近飽和狀態(tài)，離心去除少量不溶物后，裝入預先處理好的透析袋，然后醇析、干燥。氣

2、相色譜法檢測銀耳多糖純度。 2、銀耳多糖對氧化損傷誘導心肌細胞凋亡的影響將原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞隨機分為3組：①正常對照組(A組)；②H<,2>O<,2>誘導凋亡模型組(B組)；③銀耳多糖干預組(C組)，使用倒置光學顯微鏡對各組心肌細胞進行形態(tài)學觀察，并進行臺盼藍攝取率測定。Annexin V-FITC/PI雙染法標記凋亡心肌細胞，采用流式細胞術檢測各組心肌細胞凋亡指數(shù)。 3、D-半乳糖腹腔注射造成動物衰老模型，并用TP

3、進行干預按體重將小鼠隨機分為5組：正常對照組(N組)腹腔注射生理鹽水，其余四組每天按120 mg/kg腹腔注射D-半乳糖，同時，低劑量(L組)、中劑量(M組)、高劑量(H組)TP組分別每天灌胃100、200、400 mg/g TP，衰老對照組(C組)灌胃生理鹽水。8w后，處死小鼠，獲取心肌標本，進行心肌組織學研究：HE染色和衰老相關半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、TUNEL法原位檢測凋亡細胞，并對心肌組織勻漿各生化指標，包括超氧化物

4、歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)等進行定量檢測。 結果： 1、經(jīng)氣相色譜法鑒定，得到的銀耳多糖精品含糖量達80％左右，其中糖醛酸含量為13.38％； 2、細胞水平研究： (1)各組培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞具有不同的形態(tài)學特點； (2)各組心肌細胞的臺盼藍攝取率不同，B組的臺盼藍攝取率高于A組(P<0.05)；C組的臺盼藍攝取率低于B組(P<0.05)：C組的臺盼藍攝

5、取率高于A組(P<0.05)： (3)各組心肌細胞的凋亡指數(shù)不同，B組的細胞凋亡指數(shù)高于A組；C組的細胞凋亡指數(shù)低于B組(P<0.05)；C組細胞凋亡指數(shù)高于A組(P<0.05)： 3、動物實驗： (1)各組小鼠光鏡下心肌病理學檢查結果：肉眼觀，各組小鼠心臟外觀光滑紅潤，無明顯病理改變；光鏡下，與正常組小鼠心肌相比，衰老對照組及各TP干預組均無明顯病理學改變； (2)SA-β-Gal染色：陰性細胞的細胞核

6、伊紅復染為紅色，而陽性細胞的胞漿染為靛藍色或紫藍色，采用半定量計分法計算各自分值。統(tǒng)計結果表明，衰老對照組與各TP干預組的分值均高于正常組心肌(P<0.0)，即陽性細胞數(shù)高于正常組，提示D-半乳糖注射法建立小鼠衰老模型成功。在各TP干預組中，H組(400mg/kg)分值最低(P<0.05)，即該組陽性細胞數(shù)最少，衰老相關半乳糖苷酶活性最低。 (3)TUNEL法原位檢測凋亡細胞：正常組(N組)心肌細胞凋亡指數(shù)低于其余各組，分別與衰

7、老對照組(C組)、100mg/kg組(L組)、200mg/kg組(M組)、400mg/kg組(H組)比較差異有顯著意義(P<0.05)；L組與衰老對照組C組比較，盡管細胞凋亡指數(shù)有差異，但二者之間差異沒有顯著意義(P>0.05)。M、H組細胞凋亡指數(shù)均低于衰老對照組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 (4)TP對各組小鼠心肌組織勻漿的抗氧化作用的效果： N組(正常對照組)及各TP干預組組織勻漿中MDA與LP含量低于C

8、組(衰老對照組)，并有顯著性差異(P<0.05)，而N組及各TP干預組組織勻漿中GSH-Px與SOD活性高于C組(P<0.05)。同時，M組(200 mg/kg)與H組(400 mg/kg)TP干預組的MDA含量低于L組(100 mg/kg)，而其GSH-Px與SOD活性高于L組，并有顯著性差異(P<0.05)，各TP干預組的MDA含量及GSH-Px與SOD活性與TP的劑量呈一定的量效關系。 結論： 1、本實驗室自行建立