組織工程人工神經(jīng)血管化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一種理想的組織工程人工神經(jīng)應(yīng)該是由種子細(xì)胞、生物材料、細(xì)胞外基質(zhì)以及誘導(dǎo)和促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的因子等幾部分構(gòu)成的有機(jī)統(tǒng)一體。在課題組前期的工作中我們已經(jīng)先后通過(guò)探討了組織工程人工神經(jīng)的種子細(xì)胞—雪旺細(xì)胞培養(yǎng)方法，獲得了較大數(shù)量、較高純度的雪旺細(xì)胞。通過(guò)改良去細(xì)胞同種異體神經(jīng)橋接體的制備方法，獲得了較為理想的人工神經(jīng)天然支架。隨后的雪旺細(xì)胞與去細(xì)胞同種異體神經(jīng)橋接體的體外組織相容性研究也證實(shí):采用胎兔坐骨神經(jīng)培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞能在用成年兔坐骨神經(jīng)制

2、備的去細(xì)胞橋神經(jīng)接體中生長(zhǎng)良好，并且具有遷移成行的特性。在前期研究基礎(chǔ)上本課題將嘗試將血管內(nèi)皮細(xì)胞與雪旺細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)移植以促進(jìn)組織工程人工神經(jīng)血管化，進(jìn)一步探討組織工程人工神經(jīng)再血管化策略。
　　為此，本課題擬從以下三個(gè)方面開(kāi)展研究:(1)將胎兔雪旺細(xì)胞復(fù)合體橋接修復(fù)兔坐骨神經(jīng)缺損的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，明確胎兔雪旺細(xì)胞神經(jīng)復(fù)合體修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損可行性;(2)體外雪旺細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究，探討將雪旺細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)

3、的最適比例;(3)將血管內(nèi)皮細(xì)胞與組織工程人工神經(jīng)中的種子細(xì)胞-雪旺細(xì)胞聯(lián)合種植至預(yù)先制備好的去細(xì)胞同種異體神經(jīng)段中，嘗試先在體外對(duì)神經(jīng)移植體行預(yù)血管化，并用這種預(yù)血管化的人工神經(jīng)重建成年兔坐骨神經(jīng)的功能。觀察比較預(yù)血管化處理和不進(jìn)行預(yù)血管化處理兩種移植復(fù)合體對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。通過(guò)上述三個(gè)方面的研究，探討早期預(yù)血管化移植體對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　第一部分種植胎兔雪旺細(xì)胞重新細(xì)胞化的脫細(xì)胞異體神經(jīng)修復(fù)神經(jīng)缺損的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

4、>　　目的:利用胎兔坐骨神經(jīng)培養(yǎng)雪旺細(xì)胞，然后將其在體外與經(jīng)化學(xué)去細(xì)胞處理的同種異體神經(jīng)段形成重新細(xì)胞化的神經(jīng)橋接復(fù)合體，并用于修復(fù)成年兔坐骨神經(jīng)缺損，探討種植雪旺細(xì)胞的去細(xì)胞神經(jīng)橋接復(fù)合體修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損的可行性。
　　方法:實(shí)驗(yàn)包括胎兔雪旺細(xì)胞培養(yǎng)、去細(xì)胞神經(jīng)橋接體的制備以及去細(xì)胞神經(jīng)橋接體復(fù)合體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)三個(gè)部分。使用雙酶消化法培養(yǎng)雪旺細(xì)胞并將其種植于經(jīng)3％ TritonⅩ-100作用96h后的同種異體神經(jīng)中。實(shí)驗(yàn)組:將胎兔

5、雪旺細(xì)胞神經(jīng)復(fù)合體橋接用于移植修復(fù)成年兔坐骨神經(jīng)缺損。對(duì)照組:單純應(yīng)用未重新細(xì)胞化的去細(xì)胞同種異體神經(jīng)段移植修復(fù)成年兔坐骨神經(jīng)缺損。分別觀察兩組坐骨神經(jīng)的再生及功能恢復(fù)情況，觀察兔的足部潰瘍形成及愈合情況。于4周，8周，12周行肌電圖檢查，在光鏡下觀察神經(jīng)軸突的再生情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組動(dòng)物分別在術(shù)后第4周、第8周和第12周時(shí)觀察，非常明顯的排斥反應(yīng)均未在手術(shù)操作的局部區(qū)域或全身出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)組足部潰瘍

6、愈合情況、再生神經(jīng)纖維數(shù)目與對(duì)照組相比有顯著差異（對(duì)照組差于實(shí)驗(yàn)組）。神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)的比較:①在術(shù)后第4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均未出現(xiàn)特別明顯的神經(jīng)傳導(dǎo);②在術(shù)后第8周時(shí)，神經(jīng)傳導(dǎo)速度實(shí)驗(yàn)組為24.80±1.27 m/s，對(duì)照組為18.72±0.81 m/s，T值-10.91，P＜0.05;③在術(shù)后第8周時(shí)，神經(jīng)傳導(dǎo)速度實(shí)驗(yàn)組為37.95±2.43m/s，對(duì)照組為32.58±1.89 m/s，T值-5.01，P＜0.05。兩組有顯

7、著差異性。神經(jīng)纖維數(shù)目的比較:①在術(shù)后第4周時(shí)實(shí)驗(yàn)為750.65±74.24根，對(duì)照組為543.67±61.42根，T值-5.30，P＜0.05;②在術(shù)后第8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組為2067.83±231.65根，對(duì)照組為1804.50±156.65根，T值-2.29，P＜0.05;③在術(shù)后第12周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組為34340.33±124.48根，對(duì)照組為2495.17±154.95根，T值-11.25，P＜0.05。兩組比較有顯著差異性。
　

8、　結(jié)論:胎兔雪旺細(xì)胞能在經(jīng)去細(xì)胞處理的同種異體神經(jīng)中生長(zhǎng)并發(fā)揮生物活性，種植胎兔雪旺細(xì)胞重新細(xì)胞化后的同種異體神經(jīng)不僅可以為新生軸突生長(zhǎng)提供具有良好空間結(jié)構(gòu)的支架，而且與單純化學(xué)去細(xì)胞處理的異體神經(jīng)相比，重新細(xì)胞化后的同種異體神經(jīng)在誘導(dǎo)和促進(jìn)新生神經(jīng)軸突再生等方面更具優(yōu)勢(shì)。
　　第二部分胎兔血管內(nèi)皮細(xì)胞與胎兔雪旺細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)體系的建立
　　目的:在體外將雪旺細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，建立最適比例的胎兔血管內(nèi)皮細(xì)胞與胎

9、兔雪旺細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步探討組織工程人工神經(jīng)再血管化策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:取胎兔坐骨神經(jīng)以及胸主動(dòng)脈采用酶消化法分別進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)胎兔SCs和VECs，隨后將培養(yǎng)好的胎兔SCs和VECs移入含20％胎牛血清的DMEM/F12及M199的混合培養(yǎng)基中，根據(jù)移入的SCs和VECs細(xì)胞數(shù)量比例分別設(shè)為實(shí)驗(yàn)組的A組(1∶1)、B組(2∶1)、C(4∶1)三組，各組DMEM/F12及M199培養(yǎng)基的比例根據(jù)細(xì)胞比例也作相

10、應(yīng)調(diào)整。與此同時(shí)，將相同數(shù)量的SCs繼續(xù)進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)并設(shè)為對(duì)照組D。各組分別在細(xì)胞培養(yǎng)后的第1、3、5、7天，對(duì)SCs進(jìn)行計(jì)數(shù)并根據(jù)計(jì)數(shù)情況繪制SCs的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
　　結(jié)果:1隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的增加，各組SCs的數(shù)量也不斷增加，SCs和VECs能夠在同一細(xì)胞培養(yǎng)孔中各自生長(zhǎng)。2在細(xì)胞共同培養(yǎng)第1天，A、B、C三個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組D中的SCs細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著性差異(P＞0.05），在細(xì)胞共同培養(yǎng)的第3天、第5天、第7天，A組和C組SCs

11、計(jì)數(shù)與對(duì)照組D相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05），D組的SCs數(shù)量高于A、C兩組;B實(shí)驗(yàn)組的SCs數(shù)量與對(duì)照組D相比則無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組B與實(shí)驗(yàn)組A、C則有顯著差異(P＜0.05），B組SCs數(shù)量高于A、C兩組。
　　結(jié)論:利用胎兔坐骨神經(jīng)培養(yǎng)的SCs能夠在體外與利用胸主動(dòng)脈培養(yǎng)的VECs進(jìn)行共同培養(yǎng);在胎兔血管內(nèi)皮細(xì)胞與胎兔雪旺細(xì)胞體外共同培養(yǎng)的體系中，當(dāng)VECs與SCs的比例為1∶2時(shí)，SCs的生長(zhǎng)能力及活

12、性維持最好。
　　第三部分血管化同種異體神經(jīng)復(fù)合體橋接修復(fù)兔坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:探討將經(jīng)化學(xué)去細(xì)胞處理的同種異體神經(jīng)復(fù)合體預(yù)血管化處理后移植修復(fù)兔長(zhǎng)段坐骨神經(jīng)缺損的可行性以及早期血管化移植體對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　方法:將雪旺細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞在體外聯(lián)合培養(yǎng)成功后將其種植于預(yù)先制備的經(jīng)脫細(xì)胞處理完善的同種異體神經(jīng)段中，制備成預(yù)血管化的人工神經(jīng)并將其用于修復(fù)兔缺坐骨神經(jīng)缺損（實(shí)驗(yàn)組），對(duì)照組移植體中單純

13、種植雪旺細(xì)胞，無(wú)血管內(nèi)皮細(xì)胞。術(shù)后4周，8周，16周對(duì)兩組動(dòng)物行肌電圖檢查，觀察神經(jīng)功能恢復(fù)情況，然后，手術(shù)取材，應(yīng)用光鏡、電鏡觀察坐骨神經(jīng)再生和髓鞘形成情況，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)對(duì)髓鞘厚度以及有髓神經(jīng)纖維軸突的直徑、數(shù)目進(jìn)行量化分析。
　　結(jié)果:
　　1、大體觀察，術(shù)后4周、8周、16周兩組動(dòng)物全身及局部均未出現(xiàn)明顯的排斥反應(yīng)。足部潰瘍恢復(fù)情況以及步態(tài)恢復(fù)情況實(shí)驗(yàn)組均優(yōu)于對(duì)照組;
　　2、術(shù)后8周實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)傳導(dǎo)速度為23

14、.35±1.05m/s，對(duì)照組為23.11±0.80m/s，T值2.13，P＜0.05。術(shù)后16周實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)傳導(dǎo)速度為39.52±1.0 m/s，對(duì)照組為38.34±0.15 m/s，T值2.15，P＜0.05。
　　3、脛前肌濕重測(cè)量:4周時(shí)兩組動(dòng)物脛前肌濕重（實(shí)驗(yàn)組2.22±0.13g，對(duì)照組2.20±0.16g）組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組3.38±0.11 g，對(duì)照組3.28±0.07g，T值2.89，P＜

15、0.05，組間有顯著差異。術(shù)后12周實(shí)驗(yàn)組6.10±0.22g，對(duì)照組5.97±0.15g，T值2.14，P＜0.05，組間有顯著差異。
　　4、再生神經(jīng)纖維的數(shù)量:4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為922.97±25.06，對(duì)照組為901.48±12.39，T值3.26，P＜0.05，組間有顯著差異。8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為1736.44±36.28，對(duì)照組為1713.51±25.00，T值2.20，P＜0.05，組間有顯著差異。12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為2840.9

16、1±20.93，對(duì)照組為2823.74±14.42，T值2.86，P＜0.05，組間有顯著差異。
　　5、有髓神經(jīng)纖維軸突直徑:4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為5.83±0.16μm，對(duì)照組為5.58±0.42μm，T值2.27，P＜0.05，組間有顯著差異。8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為6.01±0.09μm，對(duì)照組為5.87±0.16μm，T值3.09，P＜0.01，組間有顯著差異。12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為6.11±0.08μm，對(duì)照組為6.00±0.07μm，T值4

17、.62，P＜0.0001，組間有顯著差異。
　　6、髓鞘厚度:4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為1.95±0.14μm，對(duì)照組為1.70±0.22μm，T值4.10，P＜0.05，組間有顯著差異。8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為1.99±0.11μm，對(duì)照組為1.85±0.16μm，T值3.10，P＜0.01，組間有顯著差異。12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為2.03±0.05μm，對(duì)照組為1.90±0.06μm，T值7.16，P＜0.0001，組間有顯著差異。
　　結(jié)論:應(yīng)用預(yù)