組織工程化膀胱體內(nèi)血管化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、由于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞合成分泌的內(nèi)源性蛋白表達(dá)產(chǎn)物活性高，能有效的同細(xì)胞表面受體結(jié)合，免疫排斥反應(yīng)小，副作用小，為了探索轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在組織化膀胱體內(nèi)血管化的應(yīng)用，我們將VEGF165 cDNA 克隆于真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-), 構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)/VEGF165；采用電轉(zhuǎn)化方法將含VEGF165 的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入鼠膀胱平滑肌細(xì)胞，用RT-PCR 檢測(cè)VEGF165 基因在鼠膀胱平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)，并用MTT 法檢

2、測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清液中VEGF165 的生物學(xué)活性。結(jié)果顯示將構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)/VEGF165 轉(zhuǎn)染入鼠膀胱平滑肌細(xì)胞后，VEGF的表達(dá)增高，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清液具有促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性。 為進(jìn)一步了解所轉(zhuǎn)染的膀胱平滑肌細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的促血管生成作用，我們將種植了轉(zhuǎn)染VEGF 的膀胱平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)后，移植至大鼠體內(nèi)，并以膀胱缺損自然愈合和單純植入SIS 為對(duì)照進(jìn)行觀察，于術(shù)后10 周內(nèi)每隔2 周取

3、標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)和免疫組化檢測(cè)CD34 和VEGFR2 的表達(dá)，觀察支架植入物的組織生長(zhǎng)和修復(fù)情況，結(jié)果顯示膀胱缺損自然愈合組的大鼠術(shù)后1 周時(shí)膀胱缺損區(qū)已有膀胱移行上皮形成，第2 周時(shí)新生的膀胱粘膜已覆蓋缺損區(qū)。在植入SIS 的兩組動(dòng)物中，術(shù)后1 周時(shí)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，可見膀胱移行上皮形成；術(shù)后2 周時(shí)炎性細(xì)胞減少，單純SIS 植入組和轉(zhuǎn)染VEGF 組均可見完整的上皮形成，兩組未見明顯的差異；此時(shí)已有新生毛細(xì)血管，VEGF 受體的表達(dá)呈

4、陽(yáng)性，且轉(zhuǎn)染VEGF組中新生毛細(xì)血管數(shù)量和VEGF 受體的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)高于單純SIS 植入組（P<0.05）；術(shù)后4 周時(shí)新生毛細(xì)血管形成較第2 周時(shí)明顯增多（P<0.05），但兩組間新生毛細(xì)血管數(shù)和VEGF 受體表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)未見顯著性差異（P>0.05），同時(shí)兩組可見少量平滑肌纖維形成；術(shù)后6 周以后平滑肌形成逐漸增多，到第10 周時(shí)可見明顯的平滑肌束，兩組間新生毛細(xì)血管數(shù)和VEGF 受體表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)未見顯著性差異（P>0.05

5、）。 盡管文獻(xiàn)報(bào)道制備的小腸粘膜下層中含有少量細(xì)胞生長(zhǎng)因子, 但尚不明確其在動(dòng)物體內(nèi)是否仍具有生物活性，為了解小腸粘膜下層在膀胱組織修復(fù)中外源性生長(zhǎng)因子VEGF和bFGF 釋放，我們用ELISA 法和MTT法體外測(cè)量?jī)龈蒘IS 在PBS 孵育液中VEGF 和bFGF 的含量及對(duì)上皮細(xì)胞的增殖作用；用豬小腸粘膜下層（SIS）行大鼠膀胱部分修復(fù)。術(shù)后在不同時(shí)間觀察大鼠膀胱修復(fù)情況，并用組織學(xué)免疫組化方法觀察VEGF和bFGF 的表

6、達(dá), 單純大鼠粘膜及部分肌層缺損組作為對(duì)照。結(jié)果顯示凍干SIS 在PBS 孵育液中VEGF 含量約為121.8±2.683ng/L; bFGF 含量約為93.8±3.033ng/L，且對(duì)上皮細(xì)胞有增殖作用；組織學(xué)顯示移植的SIS 上可見新生毛細(xì)血管和平滑肌肌束。免疫組化顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組VEGF 和bFGF 在術(shù)后第1 周均呈弱陽(yáng)性表達(dá)，第2 周以后實(shí)驗(yàn)組VEGF 和bFGF表達(dá)逐漸增強(qiáng)，至第6 周達(dá)到高峰，第8 周VEGF 和bFGF