己烯雌酚酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)試劑盒的研制.pdf

1、己烯雌酚(DES)屬于人工合成的雌激素，在人和動(dòng)物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生雌激素樣效應(yīng)。由于己烯雌酚對(duì)人體的致癌和致畸作用，世界各國(guó)均規(guī)定動(dòng)物養(yǎng)殖中不得以任何途徑和方式使用DES。本論文旨在研制快速檢測(cè)己烯雌酚(DES)的酶聯(lián)免疫(EIASA) 試劑盒。 首先用氯乙酸鈉修飾DES分子中的一個(gè)酚羥基從而合成單羧甲醚己烯雌酚(DES-MCME)，然后以混合酸酐法將DES-MCME 與載體蛋白(OVA) 偶聯(lián)形成完全抗原，并以紫外掃描分析完全抗原的

2、偶聯(lián)比率，再將得到的免疫原DES-BSA按免疫程序免疫新西蘭白兔。結(jié)果發(fā)現(xiàn)己烯雌酚及其衍生物存在著順反異構(gòu)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，極性有機(jī)溶劑的溶劑化作用促使順反異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化。高分辨質(zhì)譜測(cè)得合成的DES-MCME分子量為325。人工免疫原及包被原的最適結(jié)合比為13和10。采用間接酶聯(lián)免疫測(cè)定，產(chǎn)生的抗血清的稀釋度可以達(dá)到102400。 以此抗血清為基礎(chǔ)，建立DES的間接酶聯(lián)免疫方法?？疾炝朔磻?yīng)時(shí)間、離子強(qiáng)度、洗液的濃度以及抗體稀釋液的 pH

3、等影響因素。最終得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為 y=-0.2978x+1.4756，R<'2>=0.9986，其線性范圍為0.1～25ng.ml<'-1>，50％抑制率對(duì)應(yīng)的濃度 (IC<,50>)為1.89 ng·ml<'-1>，90％抑制率對(duì)應(yīng)的濃度(最低檢測(cè)限，LOD)為0.08 ng·mL<'-1>。利用五種結(jié)構(gòu)類似的甾體化合物檢測(cè)其特異性，均無明顯的交叉反應(yīng)，特異性好。利用空白樣品添加實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其精密度和準(zhǔn)確度，DES以1ng·g

4、<'-1>和5 ng·g<'-1>兩個(gè)濃度分別添加到空白樣品中測(cè)定回收率。結(jié)果表明：牛肉組織回收率為50～80％，變異系數(shù)為3.7～8.6％；豬肝的回收率為30～50％，變異系數(shù)為4.6～7.9％。 將本試劑盒與荷蘭EURO-DIAGNOSTICA 公司的試劑盒進(jìn)行比較，回收率、變異系數(shù)等結(jié)果基本一致，與LC/MS/MS方法比較，檢測(cè)結(jié)果較接近。本論文研制的ELISA 試劑盒的各項(xiàng)參數(shù)都達(dá)到了國(guó)外試劑盒的指標(biāo)和要求，可用于實(shí)際檢