HBV核酸定量檢測試劑盒的研發(fā)及T細(xì)胞免疫水平的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（HBV）為一種流行十分廣泛的部分雙鏈DNA病毒，是導(dǎo)致急慢性肝炎和肝細(xì)胞癌變的致病因子，嚴(yán)重危害了人類公共衛(wèi)生安全。目前，全世界有將近20億人感染過HBV，其中慢性感染者約為3.5億。中國HBV感染率為7.18%，大約有1億人為HBV感染者。慢性HBV感染者并不表現(xiàn)有任何臨床癥狀，但具有較強(qiáng)的傳染性并有可能發(fā)展為肝硬化及肝癌等嚴(yán)重疾病。因此檢測篩查HBV是否感染、感染后的治療效果評價以及免疫水平監(jiān)測是一項艱巨的工程。

2、>　　目前以檢測HBsAg為陽性作為HBV感染的標(biāo)志。然而在慢性感染的病人中有一部分人群針對HBsAg產(chǎn)生的細(xì)胞免疫很弱，而且有的幾乎檢測不到抗原及相應(yīng)的抗體。這部分HBsAg陰性的HBV感染者可以用核酸定量的檢測方法檢出，這就需要有可靠的HBV DNA檢測技術(shù)。而在急性HBV感染的病人中幾乎都能夠針對HBsAg、HBcAg產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫響應(yīng)。在體外檢測T細(xì)胞免疫響應(yīng)需要具有抗原投遞功能的載體將抗原遞呈給特異性T細(xì)胞。
　　本

3、研究中，為了開發(fā)高特異性、高靈敏性的HBV DNA熒光定量PCR檢測試劑盒及研究HBV感染者機(jī)體T細(xì)胞免疫水平，我們設(shè)計了以下兩部分試驗。第一部分：針對HBV不同基因型A～H高度保守區(qū)設(shè)計4對引物(HBsF1/HBsR1、HBsF2/HBsR2、HBxF/HBxR、HBcF/HBcR)和相對應(yīng)的4條Taqman探針（HBsP1、HBsP2、HBxP、HBcP）。通過用4對引物對 HBV DNA擴(kuò)增并與 T載體連接后，構(gòu)建了 pMD18-

4、T-HBs1、pMD18-T-HBs2、pMD18-T-HBx和pMD18-T-HBc4種重組質(zhì)粒，并計算拷貝數(shù)后作為熒光定量 PCR檢測 HBV DNA方法的工作標(biāo)準(zhǔn)品。經(jīng)熒光定量 PCR檢測分析發(fā)現(xiàn)， pMD18-T-HBx和pMD18-T-HBc在1.0×103copies/mL～1.0×109copies/mL時，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍相關(guān)系數(shù)R2為0.99以上，擴(kuò)增效率為95%～105%，較pMD18-T-HBs1、pMD18-T

5、-HBs2的線性范圍寬，擴(kuò)增效率高。以pMD18-T-HBc為工作標(biāo)準(zhǔn)品對熒光定量PCR檢測HBV DNA的方法學(xué)進(jìn)行評價，批內(nèi)精密度為0.12%～1.01%，批間精密度為1.99%～7.01%。該方法最低檢出限為125copies/mL，比市售同類商品檢出限低4～8倍。對HBV核酸國家標(biāo)準(zhǔn)品中陽性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性標(biāo)準(zhǔn)品符合率均為100%，對國家線性標(biāo)準(zhǔn)品檢測的線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9992。對不同類型的血樣檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EDTA抗凝的血漿檢

6、測值要高于血清檢測值，肝素鈉抗凝的血漿檢測值效果最差。對用試劑盒和熱裂解提取血漿HBV DNA檢測發(fā)現(xiàn)，試劑盒提取病毒載量較低的樣品時，效果要好于熱裂解法。對102份HBsAg（+）血漿檢測并與HBV商品化檢測試劑盒比較分析，總符合率為94.1%，相關(guān)系數(shù)R2為0.951。
　　第二部分：將含有抗原投遞系統(tǒng)LFn的核心抗原肽庫重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株E.coli BL21后，經(jīng)原核表達(dá)、IMAC親和層析、QFF離子交換層析、超濾等方