二氫楊梅素對NF-κB活化及其信號(hào)通路作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:二氫楊梅素，是在篩選NF-κB抑制劑時(shí)，發(fā)現(xiàn)的一種有效的源自天然產(chǎn)物的小分子抑制劑。它是從葡萄科蛇葡萄屬的一種木質(zhì)藤本植物中提取出來的黃酮類化合物，具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤、消炎等多種活性。在本研究中，主要檢測二氫楊梅素對TNF-α誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞中NF-κB活化的及其信號(hào)通路作用機(jī)制的影響。
　　方法:①用MTT實(shí)驗(yàn)來檢測二氫楊梅素對HeLa細(xì)胞存活率的影響;②采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來檢測二氫楊梅素對NF

2、-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響;③通過蛋白免疫印跡法來檢測二氫楊梅素對NF-κB相關(guān)蛋白表達(dá)影響;④利用RT-PCR實(shí)驗(yàn)來檢測二氫楊梅素對cyclin D1/iNOS/VEGF mRNA表達(dá)的影響;⑤免疫熒光試驗(yàn)來檢測藥物對p65核轉(zhuǎn)位的影響;⑥蛋白免疫印跡法來檢測二氫楊梅素對TNFR1信號(hào)通路的影響。⑦采用MTT法、細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)、EdU實(shí)驗(yàn)來檢測二氫楊梅素對HeLa細(xì)胞增殖的影響;⑧利用流式細(xì)胞術(shù)來檢測藥物對HeLa細(xì)胞凋亡率的影響。
　

3、　結(jié)果:1.MTT實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告基因顯示，二氫楊梅素抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化且在20-200 uM時(shí)，無明顯的細(xì)胞毒性。沒有明顯的細(xì)胞毒性。2.蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明，二氫楊梅素劑量性抑制IκBα的磷酸化和降解及p65核轉(zhuǎn)移，同時(shí)也抑制NF-κB靶基因的表達(dá);免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，二氫楊梅素抑制p65的核移位。3.蛋白免疫印跡結(jié)果證明，二氫楊梅素劑量性抑制TNFR1信號(hào)通路中IKKα/β的磷酸化，劑量性抑制TRAF2和RI

4、P1的表達(dá)。4.RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二氫楊梅素劑量性抑制cyclin D1/iNOS/VEGF mRNA的表達(dá)。5.通過噻唑藍(lán)比色法、細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)、EdU實(shí)驗(yàn)得出二氫楊梅素可抑制HeLa細(xì)胞增殖。6.流式細(xì)胞術(shù)證明，二氫楊梅素促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論:二氫楊梅素抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性及相關(guān)蛋白的表達(dá);二氫楊梅素抑制凋亡、增殖、遷移和血管生成等蛋白和mRNA的表達(dá);二氫楊梅素能夠抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)T