根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)深綠木霉(Trichoderma atroviride)T23轉(zhuǎn)化體系的建立以及高效降解敵敵畏突變株篩選與應(yīng)用研究.pdf

1、本研究成功建立了高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化深綠木霉(Trichoderma atroviride)T23轉(zhuǎn)化體系,轉(zhuǎn)化效率可達(dá)50個(gè)轉(zhuǎn)化子/107個(gè)孢子。從110株穩(wěn)定遺傳的突變株中篩選到7株敵敵畏降解率顯著變化的突變子。其中兩株(AMT-12和AMT-28)敵敵畏降解率較出發(fā)菌T23提高10％以上,生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)孢能力明顯下降,但其對(duì)敵敵畏的耐受性與T23基本一致。另外,還有5株突變子.AMT-18、AMT-25、AMT-44、AMT-

2、64和AMT-92的降解率較T23降低70％,但產(chǎn)孢能力保持不變,它們對(duì)敵敵畏的耐受能力是T23的4倍(800μg/mL)。Southern雜交檢測(cè)證實(shí)AMT-12和AMT-28是T-DNA單拷貝插入突變子,而另外5株降解率下降的突變子為T-DNA多拷貝插入。我們克隆了突變株AMT-12和AMT-28的側(cè)翼序列,其長(zhǎng)度分別為1845bp和1730bp。經(jīng)BLAST分析發(fā)現(xiàn)序列與深綠木霉測(cè)序菌株IMI206040分別具有89％和88％的相

3、似性。但是,這2個(gè)側(cè)翼序列所在的基因與降解敵敵畏的關(guān)系還需深入研究。
　　 為了深入研究木霉在處理敵敵畏廢水中的作用,試驗(yàn)以突變株AMT-28為例,采用海藻酸鈣滴珠法建立了其孢子固定化技術(shù)體系,并探討了深綠木霉菌生物降解敵敵畏的可能機(jī)制。在純培養(yǎng)條件下,以海藻酸鈣固定107個(gè)孢子(107孢子/100mL的3％海藻酸鈉懸液)降解敵敵畏的效果最好。與固定化菌絲和非固定化菌絲相比,固定化孢子對(duì)敵敵畏的降解率有顯著性提高。在重復(fù)利用實(shí)驗(yàn)

4、中,固定化孢子和固定化菌絲小球在5個(gè)連續(xù)批次測(cè)試中顯示了良好的降解能力,且隨著批次增加,固定化孢子對(duì)敵敵畏的降解率有一定程度的提高。固定化菌絲小球在儲(chǔ)存一個(gè)月后,其降解能力大大下降,而固定化孢子非但沒(méi)有下降,還有某種程度的提高。為了監(jiān)測(cè)菌絲體對(duì)敵敵畏的降解情況,實(shí)驗(yàn)中采用了HPLC法分析了突變株AMT-28的發(fā)酵液,確認(rèn)AMT-28能夠在7天內(nèi)完全降解敵敵畏。同時(shí),利用缺陷培養(yǎng)基純培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),AMT-28能夠在無(wú)外加碳源或者磷源的情況下降