替加環(huán)素與5種抗生素對多重耐藥鮑曼不動桿菌的體外聯(lián)合藥敏實驗研究.pdf

1、目的:鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumanii，ABA)是一種革蘭陰性桿菌。普遍分布于自然界水及泥土、病院及人體皮膚表面、呼吸道、消化道和泌尿生殖道。鮑曼不動桿菌作為一種條件致病菌，當機體免疫力低下或免疫功能缺陷時會引起感染。鮑曼不動桿菌的耐藥機制較為復(fù)雜，往往出現(xiàn)多重耐藥菌株或泛耐藥株。使得臨床醫(yī)生在治療時，往往在選擇藥物時不知所措，成為臨床治療的一大難題。隨著醫(yī)療水平的不斷進步，越來越多的抗生素被大量的應(yīng)用于臨床，

2、這也使得鮑曼不動桿菌在近年也成為醫(yī)院性感染致病菌中較為常見的一種細菌。通過比較2005-2014年的CHINET不動桿菌屬耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，我國不同地區(qū)19家醫(yī)院2005年從臨床分離的鮑曼不動桿菌為2016株，而這一數(shù)字在2013年達到頂峰9024株。而且鮑曼不動桿菌對各種抗生素的敏感性也逐年減低，根據(jù)CHINET數(shù)據(jù)，鮑曼不動桿菌對頭孢哌酮-舒巴坦和米諾環(huán)素的耐藥率相對較低，分別為31.9-51.1％和5.4％-41.2％，其次為阿

3、米卡星（43.7％-64.1％），亞胺培南（31.7％-65.8％），而對其他的抗菌藥物的耐藥率均達到50％以上。而且最近5年有明顯上升的趨勢，如頭孢哌酮-舒巴坦就從2007年的5.4％猛增至2014年的39.6％，而亞胺培南的耐藥率也從2007年的37.7％上升至2014年的65.8％。而且多重耐藥鮑曼不動桿菌(multidrug-resistant A.baumannii)和泛耐藥的鮑曼不動桿菌(extremely-drug res

4、istant A.baumannii)占比也是逐年增加，2014年基本都達到了45％以上?；颊叻植糏CU患者分離出的鮑曼不動桿菌的耐藥率較高，一般均在75％以上。這可能與ICU的患者免疫力較差，且長期大量使用廣譜抗生素有關(guān)。因此也有學(xué)者將多重耐藥的鮑曼不動桿菌形象地成為21世紀革蘭陰性桿菌中的“耐甲氧西林金黃色葡萄球菌”(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)。
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5、2年的《中國鮑曼不動桿菌感染診治與防控專家共識》中提出對于泛耐藥的鮑曼不動桿菌的治療提倡聯(lián)合用藥。目前臨床常用于治療鮑曼不動桿菌的抗生素有多粘菌素，替加環(huán)素、亞胺培南、頭孢哌酮-舒巴坦、甚至三、四代頭孢等。碳青霉烯類抗生素的耐藥率逐年增加，目前有專家建議加大其劑量使其在血藥濃度高于MIC的時間延長以到達殺菌效果，但是目前缺乏大規(guī)模臨床實踐研究。
　　替加環(huán)素為甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物的第一個品種，對多重耐藥的鮑曼不動桿菌有著較高的敏感

6、性。由于其在人體組織分布廣泛，因此血藥濃度、腦脊液藥物濃度較低，需與其他抗菌藥物聯(lián)用較好。目前替加環(huán)素在國內(nèi)上市時間較短，缺乏較多的臨床試驗和體外藥敏實驗研究。目前國內(nèi)關(guān)于替加環(huán)素對鮑曼不動桿菌的敏感性的報道差異較大，這可能與地域、用藥劑量等有一定關(guān)系。而且臨床常用于治療鮑曼不動桿菌的抗生素的研究種類較少如三、四代頭孢，氟喹諾酮類藥物和氨基糖苷類藥物等。隨著替加環(huán)素的耐藥率有逐年上升的趨勢，聯(lián)合用藥勢在必行。因此本實驗用替加環(huán)素與亞胺培

7、南、頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢曲松、左氧氟沙星、慶大霉素這5種臨床常用于鮑曼不動桿菌治療的抗生素單藥及兩藥聯(lián)用的體外活性藥敏實驗的研究，以期發(fā)現(xiàn)較好的聯(lián)合用藥方案，為臨床合理使用抗生素提供用藥參考。
　　研究方法:
　　1.菌株
　　實驗所用的鮑曼不動桿菌均來自2015年3月到2016年10月遼寧省人民醫(yī)院微生物室從臨床分離出的鮑曼不動桿菌260株，經(jīng)PHONIX、VITECK鑒定，同時經(jīng)過紙片擴散法測試，將對3個及以上種

8、類抗生素耐藥的鮑曼不動桿菌列入實驗菌株，共計50株
　　2.標準質(zhì)控菌株
　　ATCC35218，ATCC25922，均由遼寧省人民醫(yī)院微生物室提供。
　　3.抗菌藥物
　　(1)哌拉西林、頭孢哌酮/舒巴坦、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、復(fù)方新諾明、四環(huán)素的藥敏紙片均購自O(shè)xoid賽默飛世爾科技有限公司。(2)注射用替加環(huán)

9、素:購自輝瑞制藥有限公司(3)硫酸慶大霉素注射液:購自河南潤弘制藥股份有限公司(4)注射用頭孢曲松鈉:購自上海羅氏制藥有限公司(5)鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液:購自揚子江藥業(yè)集團有限公司(6)注射用頭孢哌酮舒巴坦鈉:購自輝瑞制藥有限公司。(7)注射用亞胺培南西司他丁鈉:購自杭州默沙東制藥有限公司。
　　4.實驗方法
　　選取臨床標本分離出的細菌，經(jīng)哥倫比亞血平板或麥康凱平板18-24小時培養(yǎng)后，經(jīng)Vitek2 compact

10、全自動分析儀來鑒定，確認為鮑曼不動桿菌后放入脫脂牛奶中于-80℃冰箱中保存。將已經(jīng)鑒定的鮑曼不動桿菌菌株從冰箱中取出并接種在一次性哥倫比亞血平板上并放入5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時。挑取培養(yǎng)后18-24h的純培養(yǎng)菌落4-5個。制備成菌懸液。將配好的菌懸液放入比濁儀中，調(diào)整濃度，使其最終達到0.5麥氏濁度單位。用無菌棉簽蘸取校正過的菌懸液，在試管壁上擠壓幾回，壓去多余的菌液，涂布整個MH培養(yǎng)基表面。涂布菌液的平板于室溫3-5m

11、in后，用紙片分配器，將抗生素藥片貼于平板表面，放置于5％的CO2培養(yǎng)箱中18-24小時后，將對青霉素類，頭孢類，碳青霉烯類，氟喹諾酮類，氨基糖苷類，四環(huán)素類中的3類抗生素耐藥的鮑曼不動桿菌劃歸為多重耐藥的鮑曼不動桿菌。
　　選取已經(jīng)判定為多重耐藥的鮑曼不動桿菌50株，將其接種于一次性哥倫比亞血平板上，放置于37℃的CO2孵箱中孵育24小時后取出，并用無菌棉簽從哥倫比亞血平板上挑取菌落2-3個，在試管與液面接觸處細細研磨，使菌落完

12、溶于生理鹽水中，再使用比濁儀校正濁度至0.5麥氏濁度，此時的細菌數(shù)為108CFU/ml。再進行100倍稀釋至106CFU/ml。
　　從-80℃冰箱中取出已經(jīng)配置好的抗生素各一支，待其室溫溶解后將其置于振蕩器混勻，并配置成相應(yīng)濃度的抗生素應(yīng)用液，無菌操作將事先倍比稀釋好的不同濃度的抗生素藥物溶液分別加入已經(jīng)滅菌的96孔聚苯乙烯板的各自相對應(yīng)的孔中，其中第1孔至第11孔加入抗生素，每孔100μl，第12孔加入100μl的肉湯，作為生

13、長對照。將已經(jīng)稀釋好的濃度為106CFU/ml的菌懸液加入第1孔至第12孔中，每個實驗菌株為一排，使得最終的每孔細菌數(shù)為5×105CFU/ml.此時，每孔中含200μl的實驗液體，抗生素與菌懸液各100μl。將加好的96孔聚苯乙烯板放入37℃的孵育箱中孵育18-24后觀察結(jié)果，每行以肉眼可見的不生長鮑曼不動桿菌的實驗孔的抗生素濃度作為該抗生素的最小抑菌濃度值，并分別記錄。
　　根據(jù)之前測定好的單藥MIC值，選擇聯(lián)合用藥的藥物濃度，

14、以單藥MIC為中位數(shù)，各向上和向下延展稀釋度。一般選擇8個以上的稀釋濃度。配置抗生素的方法如單藥MIC測定時的方法?？v向(A-H)加入替加環(huán)素的降梯度方向，根據(jù)抗生素的不同，橫向（1-12）分別加入5種與替加環(huán)素聯(lián)合的抗生素。每孔分別加入2種聯(lián)合用藥的抗生素各50μ l后再加入濃度為5×105CFU/ml的菌懸液100μl，震蕩混勻后，將96孔板放入孵育箱中，培養(yǎng)18-24小時后觀察5種抗生素與替加環(huán)素兩兩應(yīng)用后的MIC替加環(huán)素和MIC

15、5種抗生素。
　　FIC指數(shù)=MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用。FIC指數(shù)判讀標準:當FIC指數(shù)小于0.5時，兩種抗生素為協(xié)同作用;當FIC指數(shù)為0.5-1時，兩種抗生素為相加作用;當FIC指數(shù)大于1且小于2時，兩種抗生素為無關(guān)作用;當FIC指數(shù)大于2時，兩種抗生素為拮抗作用。
　　結(jié)果:1、經(jīng)過紙片擴散法復(fù)核后，多重耐藥的鮑曼不動桿菌的檢出率為86.2％。(50/58)。2、50株鮑曼不動菌對

16、14種臨床常用于治療鮑曼不動桿菌的抗生素耐藥性都達到了80％以上，敏感性中對阿米卡星(14％)、復(fù)方新諾明(14％)、四環(huán)素(14％)、亞胺培南(12％)敏感性較高，但也不甚理想、耐藥性中，頭孢哌酮-舒巴坦(80％)，阿米卡星(84％)、復(fù)方新諾明(84％)相對較好，頭孢哌酮-舒巴坦中介率最高(18％)。3、替加環(huán)素、亞胺培南、頭孢哌酮舒巴坦、左氧氟沙星、頭孢曲松單獨使用的MIC90分別為1μg/ml、256μ g/ml、256μ g/

17、ml、128μ g/ml、2048μ g/ml，當與替加環(huán)素分別聯(lián)合應(yīng)用后MIC90降為0.25μ g/ml、64μ g/ml、128μ g/ml、64μ g/ml、1024μ g/ml。這4種抗生素均對替加環(huán)素表現(xiàn)出比較好的協(xié)同和相加作用。慶大霉素在與替加環(huán)素聯(lián)合使用后替加環(huán)素和慶大霉素的MIC由單獨使用的1μg/ml和2048μg/ml上升至2μg/ml和4096μg/ml，顯示出拮抗的作用。
　　結(jié)論:1、替加環(huán)素與亞胺培南