轉(zhuǎn)錄因子ISL-1在誘導(dǎo)心室肌細(xì)胞向起搏樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、心臟正常節(jié)律的沖動(dòng)起源于竇房結(jié)。竇房結(jié)區(qū)域在心臟中是一個(gè)特化的結(jié)構(gòu)，其內(nèi)包含的少于1萬個(gè)起搏細(xì)胞負(fù)責(zé)整個(gè)心臟節(jié)律的產(chǎn)生。當(dāng)竇房結(jié)起搏功能衰竭時(shí)，數(shù)以億計(jì)的工作肌細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)功能障礙導(dǎo)致緩慢型心律失常，嚴(yán)重時(shí)會(huì)危及生命。作為緩慢型心律失常的新型治療方法，生物起搏旨在修復(fù)心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)，以恢復(fù)心臟的起搏和傳導(dǎo)功能。過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子實(shí)現(xiàn)生物起搏是最近研究的熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子ISL-1是竇房結(jié)發(fā)育過程中重要的上游調(diào)控因子，在竇房結(jié)起搏功能的維持中扮演關(guān)鍵

2、的角色。本研究旨在驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子ISL-1在成年小鼠心臟中的表達(dá)并探索轉(zhuǎn)錄因子ISL-1能否誘導(dǎo)心室工作肌細(xì)胞向起搏樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)生物起搏。
　　本研究包含三個(gè)實(shí)驗(yàn):第一部分確定成年小鼠竇房結(jié)區(qū)域并對分離得到的起搏細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)及電生理特性檢查;第二部分通過熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡及組織切片免疫熒光等實(shí)驗(yàn)方法，確定轉(zhuǎn)錄因子ISL-1在成年小鼠包括竇房結(jié)區(qū)域在內(nèi)的心臟各部位的表達(dá)情況;第三部分構(gòu)建ISL-1基因過表達(dá)腺病

3、毒，并利用ISL-1腺病毒作為載體，在體外培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細(xì)胞及成年小鼠心室內(nèi)過表達(dá)ISL-1，以驗(yàn)證ISL-1能否誘導(dǎo)心室工作肌細(xì)胞出現(xiàn)起搏樣細(xì)胞特征。
　　首先，第一部分實(shí)驗(yàn)確定了小鼠竇房結(jié)區(qū)域位于上下腔靜脈與右心房交匯處，并驗(yàn)證了分離得到的竇房結(jié)細(xì)胞具備自發(fā)搏動(dòng)并記錄到If電流，具有典型的起搏細(xì)胞形態(tài)及電生理特征，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了陽性對照;在第二部分的實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)錄因子ISL-1的表達(dá)情況得以確定，熒光定量實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯

4、示ISL-1主要在成年小鼠的竇房結(jié)區(qū)域表達(dá)，而在成年小鼠的心室肌細(xì)胞中表達(dá)較低（僅為竇房結(jié)組織的約1/330）;應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡方法顯示轉(zhuǎn)錄因子ISL-1高表達(dá)于成年小鼠的竇房結(jié)區(qū)域，而在成年小鼠的心房及心室組織幾乎不表達(dá);利用免疫熒光可以直接觀察ISL-1的表達(dá)及分布情況，ISL-1在竇房結(jié)區(qū)域熒光信號最強(qiáng)，而且聚集在細(xì)胞核內(nèi)，而在心室組織中未能檢測到ISL-1的信號。上述三種方法均證實(shí)了轉(zhuǎn)錄因子ISL-1高表達(dá)于成年小鼠的竇房結(jié)區(qū)

5、域，而在成年小鼠的心室肌細(xì)胞內(nèi)幾乎不表達(dá)。最后利用構(gòu)建的腺病毒作為載體，在體外培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細(xì)胞中過表達(dá)了ISL-1后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生類竇房結(jié)細(xì)胞樣變化。同時(shí)，細(xì)胞的自律性顯著提高。同樣通過在成年小鼠心室內(nèi)注射腺病毒使其過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子ISL-1，可以誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)頻發(fā)室性早搏。通過給予異丙腎上腺素刺激，ISL-1過表達(dá)小鼠出現(xiàn)房室分離，室性節(jié)律快于竇性心律。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ISL-1過表達(dá)誘導(dǎo)的心室自律性的提高與心室肌細(xì)胞表達(dá)譜向起搏