miRNA-709在紅細(xì)胞發(fā)育過程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　本研究宗旨是依據(jù)miRNAs在14.5天胚齡的小鼠幼紅細(xì)胞中的表達(dá)情況，篩選出在紅細(xì)胞發(fā)育早期有表達(dá)差異的miRNAs，研究相應(yīng)miRNAs對(duì)小鼠紅細(xì)胞發(fā)育的影響，并探討其機(jī)制。
　　方法:
　　1、通過流式細(xì)胞儀(FCM)分選小鼠14.5天胚胎肝的幼紅細(xì)胞;通過磁珠分選法篩選小鼠胚胎肝的紅細(xì)胞前體細(xì)胞和造血干細(xì)胞(FLEPHSCs)并使其在體外分化;利用基因芯片檢測(cè)miRNAs在14.5天胚胎肝的幼紅細(xì)胞

2、中的表達(dá)差異;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-RT PCR)技術(shù)檢測(cè)miRNAs在骨髓、外周血、14.5天胚胎肝幼紅細(xì)胞、FLEPHSCs、紅系G1E細(xì)胞、MEL細(xì)胞中的表達(dá)情況;
　　2、通過T4克隆技術(shù)構(gòu)建miR-709-MSCV-PIG質(zhì)粒，將質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，包裝得到逆轉(zhuǎn)錄病毒，然后感染FLEPHSCs和MEL細(xì)胞。流式檢測(cè)Ter119+/CD71+細(xì)胞，吉姆薩染色之后進(jìn)行細(xì)胞涂片，檢測(cè)對(duì)紅細(xì)胞分化的影響;通過

3、細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察對(duì)紅細(xì)胞增值的影響。
　　3、通過生物學(xué)預(yù)測(cè)軟件TargetScan及miRbase等數(shù)據(jù)庫的查詢，預(yù)測(cè)miR-709的靶基因?yàn)镚ATA-1;構(gòu)建GATA-1的3'非編碼區(qū)(3'untranslated region，3'UTR)與pGL-3融合質(zhì)粒，雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證miR-709對(duì)其靶基因GATA-1的直接靶向調(diào)控作用。
　　4、q-RTPCR方法檢測(cè)FLEPHSCs分化過程中miR-709，GATA-1，m

4、iR-451的表達(dá)情況。通過q-RTPCR方法和Western blotting方法檢測(cè)FLEPHSCs和MEL細(xì)胞在miR-709過表達(dá)后靶基因GATA-1 mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化以及與紅系相關(guān)的紅系標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1、miR-709在小鼠14.5天胚胎肝的幼紅細(xì)胞，骨髓有核紅細(xì)胞，紅系G1E細(xì)胞，MEL細(xì)胞中高表達(dá);在外周血成熟紅細(xì)胞，骨髓網(wǎng)織紅細(xì)胞中低表達(dá);在FLEPHSCs中表達(dá)先升

5、高后降低。
　　2、成功構(gòu)建miR-709-MSCV-PIG逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染和嘌呤霉素篩選后，Real-time PCR結(jié)果顯示與空載體對(duì)照組比較，miR-709-MSCV-PIG在細(xì)胞內(nèi)得到了高表達(dá)。有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。過表達(dá)miR-709的紅細(xì)胞中，成熟紅細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組明顯下降;細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示與空載體相比，細(xì)胞數(shù)目明顯增多。
　　3、生物學(xué)信息提示，小鼠的GATA-13'UTR區(qū)域與m

6、iR-709具有2處綁定位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明miR-709能綁定GATA-13'UTR。
　　4、在FLEPHSCs細(xì)胞中，miR-709表達(dá)先升高后降低，GATA-1和miR-451的表達(dá)緩慢升高，說明對(duì)其在轉(zhuǎn)錄后水平上進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。WT型小鼠的FLEPHSCs細(xì)胞中過表達(dá)miR-709，導(dǎo)致GATA-1的mRNA和蛋白水平下降。構(gòu)建的miR-709-MSCV-PIG質(zhì)粒感染進(jìn)入紅系細(xì)胞株后紅系相關(guān)的紅系標(biāo)志物的mRNA