Myocardin基因沉默在PDGF-BB誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌樣細(xì)胞分化過程中的作用.pdf

1、背景:動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈硬化的血管病中最常見、最重要的一種疾病。在國內(nèi)外均是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病,并隨著生活條件的改善動(dòng)脈粥樣硬化性疾病日趨高發(fā),呈年輕化發(fā)展趨勢(shì)。自從1904年德國萊比錫病理學(xué)家Marchand首次提出動(dòng)脈粥樣硬化一詞以來,學(xué)者就一直在探索動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制,可以肯定的是血管平滑肌細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)著重要地位。隨著干細(xì)胞這門新興學(xué)科的發(fā)展,使得在這古老的疾病認(rèn)識(shí)上有了新的補(bǔ)充。在這個(gè)背景下

2、本實(shí)驗(yàn)結(jié)合干細(xì)胞技術(shù)和基因調(diào)控技術(shù)做出探索。
　　目的:構(gòu)建myocardin特異性shRNA(short hairpin RNA)真核表達(dá)載體,體外觀察其對(duì)myocardin基因的沉默效應(yīng)及對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSCs)向平滑肌樣細(xì)胞分化過程中的影響。
　　方法:分離并培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;利用血小板源性生長因子(platelet-derived growth facto

3、r,PDGF-BB)聯(lián)合高濃度胎牛血清(20％FBS)誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌樣細(xì)胞分化;構(gòu)建含u6啟動(dòng)子和myocardin特異性短發(fā)卡RNA(shRNA)編碼序列的真核表達(dá)載體pGen-myo-shRNA為干擾質(zhì)粒以及含非特異性shRNA編碼序列的質(zhì)粒載體pGenesil-Con(pCon)為陰性對(duì)照質(zhì)粒。將誘導(dǎo)培養(yǎng)8天后的間充質(zhì)干細(xì)胞分做以下三個(gè)實(shí)驗(yàn)組:一是空白對(duì)照組,只加入轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine2000;二

4、是陰性對(duì)照組,加入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000和陰性對(duì)照質(zhì)粒(pCon);三是干擾組,加入轉(zhuǎn)染試劑和pGen-myo-shRNA干擾質(zhì)粒。分別于轉(zhuǎn)染48h后用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)myocardin mRNA表達(dá)的變化;同時(shí)用免疫組化方法檢測(cè)細(xì)胞平滑肌肌球蛋白重鏈(SM myosin heavy chain, SM-MHC)的表達(dá)及結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變來鑒定平滑肌樣細(xì)胞的分化。
　　結(jié)果:經(jīng)過測(cè)序鑒定,成功地構(gòu)建了

5、myocardin特異性 shRNA真核表達(dá)載體pGen-myo-shRNA。并且pGen-myo-shRNA干擾質(zhì)粒體外成功轉(zhuǎn)染小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞后,RT-PCR結(jié)果顯示:干擾組細(xì)胞(0.411±0.013)較空白對(duì)照組(0.719±0.017) myocardin mRNA表達(dá)下調(diào)42.86%,其差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05),陰性對(duì)照組細(xì)胞較空白對(duì)照組而言表達(dá)無明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05);同時(shí)免疫組化結(jié)果也表明

6、:干擾組細(xì)胞 SM-MHC陽性表達(dá)水平(195.73±5.08)低于空白對(duì)照組(171.37±6.52),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05),陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間無明顯差異,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)。
　　結(jié)論:小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在PDGF-BB及高濃度胎牛血清誘導(dǎo)培養(yǎng)下可表達(dá)平滑肌細(xì)胞晚期標(biāo)志基因SM-MHC和發(fā)生近似平滑肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變,說明小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有向平滑肌樣細(xì)胞分化的潛能;構(gòu)建的pGen-my