重組人Delta-like1蛋白的表達(dá)及其對Raji細(xì)胞作用的初步研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、Notch信號途徑廣泛存在于多種生物體內(nèi),進(jìn)化上高度保守,在胚胎發(fā)育、血細(xì)胞發(fā)育及腫瘤形成等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用。目前體外研究Notch信號對細(xì)胞增殖、分化和凋亡的作用多采用Notch配體刺激。Notch配體表達(dá)系統(tǒng)分為真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)。真核表達(dá)絕大多數(shù)是哺乳動物細(xì)胞系,如CHO,COS7等,但由于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成本高、難操作、表達(dá)水平低,限制其廣泛應(yīng)用。而原核表達(dá)系統(tǒng)由于沒有翻譯后加工修飾系統(tǒng),表達(dá)的真核細(xì)胞

2、蛋白質(zhì)多以包涵體形式表達(dá),復(fù)性純化方法復(fù)雜。而畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)兼有原核生物和真核生物的某些優(yōu)點(diǎn):有翻譯后加工修飾系統(tǒng),酵母能在簡單廉價的培養(yǎng)基中快速高密度地繁殖,產(chǎn)量高,成本低,可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。因此在選擇Notch配體的表達(dá)系統(tǒng)中我們首先選者畢赤酵母,其次是原核表達(dá)系統(tǒng),但需要實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá),以利于大規(guī)模應(yīng)用。
  Notch信號在造血系統(tǒng)發(fā)育中起著十分重要的作用:Notch信號使共同淋巴樣祖細(xì)胞向T細(xì)胞方向分化,抑制向B細(xì)胞方

3、向的分化;在外周脾臟B細(xì)胞發(fā)育中,Notch信號激活使其向邊緣帶B細(xì)胞方向分化。此外,Notch信號的失調(diào)與血液系統(tǒng)的許多腫瘤相關(guān),Notch信號與T細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān),Notch在其中起著癌基因的作用。但Notch信號在B細(xì)胞腫瘤中的作用仍沒有定論:Notch促進(jìn)B細(xì)胞腫瘤的發(fā)生,還是抑制B細(xì)胞腫瘤的生長?Notch信號在B細(xì)胞腫瘤中起著癌基因作用,還是抑癌基因?不同研究組結(jié)論不一致。
  我們主要進(jìn)行了如下幾方面的研究:<

4、br>  1、畢赤酵母表達(dá)重組人Delta-like1(hDll1)蛋白。PCR法擴(kuò)增hDll1-127-225和hDll1-26-225片段,截取已有質(zhì)粒pMikneo-Fc中Fc片段,構(gòu)建酵母表達(dá)載體pPIC9K-hDll1-127-225-Fc,pPIC9K-hDll1-26-225-Fc和pPIC9K-Fc,經(jīng)過組氨酸營養(yǎng)缺陷,G418抗生素雙重篩選陽性轉(zhuǎn)化子,甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。
  2、重組hDll1的原核表達(dá)。構(gòu)建原核表達(dá)

5、載體pGEX4T1-hDll1-127-225,pGEX4T1-hDll1-26-225,pET32a-hDll1-127-225和pET32a-hDll1-26-225,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,IPTG、30℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)。
  3、重組hDll1蛋白生物學(xué)功能的檢測。通過報告基因?qū)嶒?yàn)及檢測Notch下游分子Hes1的表達(dá)檢測重組hDll1的生物學(xué)活性,并通過FACS及RT-PCR檢測其對Raji細(xì)胞Notch信號的激活作用。

6、r>  4、Notch信號對Raji細(xì)胞凋亡、增殖的作用;Notch通路與BCR通路共同對Raji細(xì)胞生長的影響及其可能的分子基礎(chǔ)。重組hDll1激活Raji細(xì)胞Notch或GSI阻斷其Notch通路,以AnnexinV-PI染色、CFSE染色,通過流式細(xì)胞儀FACS研究Raji細(xì)胞凋亡、增殖。WesternBlot檢測與Raji細(xì)胞增殖密切相關(guān)c-myc的變化。
  結(jié)論:實(shí)現(xiàn)了hDll1-26-225-Fc和人IgG1Fc片段

7、的在畢赤酵母中的表達(dá);30℃低溫誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)重組hDll1(His-hDll1-127-225)的可溶性表達(dá);通過報告基因?qū)嶒?yàn),F(xiàn)ACS及檢測Notch下游分子Hes1的mRNA、蛋白表達(dá)驗(yàn)證了重組hDll1(His-hDll1-127-225)的生物學(xué)活性;Notch激活抑制Raji細(xì)胞凋亡,促進(jìn)其增殖,Notch阻斷劑GSI促進(jìn)Raji細(xì)胞凋亡,抑制其增殖;Notch通路與BCR通路協(xié)同促進(jìn)Raji細(xì)胞的增殖,這種協(xié)同作用能被GSI所阻

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