重組人干細(xì)胞因子的表達(dá)、復(fù)性、純化及其對(duì)臍帶血體外擴(kuò)增作用研究.pdf

1、目的:通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，由包涵體經(jīng)純化復(fù)性后獲取重組人干細(xì)胞因子(recombinant human stem cell factor，rhSCF)蛋白，同時(shí)制備相應(yīng)的單克隆抗體，以新鮮臍血中分離的單核細(xì)胞(mononuclear cell，MNC)對(duì)SCF及其單抗的活性進(jìn)行檢測(cè)。
　　 方法:通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲取SCF包涵體，經(jīng)透析復(fù)性，CM-Sepharose純化后獲得蛋白。用Ficoll密度

2、梯度離心法從臍帶血中提取MNC，利用免疫磁珠分選法(magnetic cell sorting，MACS)分選其中具有CD34+抗原表位的細(xì)胞，根據(jù)之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用一定濃度的血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、FLT-3配體(FLT-3 ligand，F(xiàn)L)及實(shí)驗(yàn)獲取的重組人干細(xì)胞因子(rhSCF)組合對(duì)臍帶血進(jìn)行七天體外擴(kuò)增以檢測(cè)rhSCF生物活性。制備篩選得到高滴度單克隆細(xì)胞株，使用該單克隆抗體通過(guò)臍帶血體外擴(kuò)增

3、觀察該單抗對(duì)rhSCF生物活性的抑制作用。培養(yǎng)七天后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD34+陽(yáng)性細(xì)胞比例。使用肽圖分析對(duì)rhSCF進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能研究。
　　 結(jié)果:成功使用IPTG在大腸桿菌BL21誘導(dǎo)表達(dá)rhSCF蛋白，包涵體經(jīng)復(fù)性及CM-Sepharose純化獲得高純度的rhSCF蛋白。篩選獲得高滴度的rhSCF單克隆抗體細(xì)胞株23C8。干細(xì)胞體外擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)表明rhSCF蛋白FL及TPO聯(lián)用，具有協(xié)同刺激CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增的作用;單克

4、隆抗體23C8可以特異性的抑制rhSCF促進(jìn)干細(xì)胞體外擴(kuò)增的生物活性。肽圖分析結(jié)果表明，rhSCF的活性位點(diǎn)位于第93-165位氨基酸序列中。
　　 結(jié)論:成功建立rhSCF原核表達(dá)、復(fù)性和純化體系。rhSCF蛋白具有良好生物學(xué)活性，與同類標(biāo)準(zhǔn)品相比無(wú)明顯差異;獲得可分泌高滴度單克隆抗體的23C8單克隆細(xì)胞株;實(shí)驗(yàn)表明單克隆抗體23C8的結(jié)構(gòu)域可結(jié)合rhSCF的生物活性位點(diǎn)，能特異性抑制rhSCF的活性，阻止CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)