可溶性重組人精囊蛋白1片段的原核表達(dá)及其對(duì)精子活力的影響.pdf

1、近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外針對(duì)男性避孕疫苗的研究取得了突出的進(jìn)展，主要集中于:(1)幾種非常有潛能的重要蛋白被發(fā)現(xiàn)，包括Eppin，F(xiàn)SHR，Izumo，CRISP-1，CatSper1等;(2)佐劑及免疫誘導(dǎo)等方面更成熟。這些為研制高效、可逆性避孕疫苗提供了重要的前提條件。然而，由于天然自身抗原的抗原性弱，且缺乏蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的解析，嚴(yán)重制約了對(duì)其關(guān)鍵功能域的改造研究，迄今仍無(wú)理想的避孕疫苗問(wèn)世。
　　人精囊蛋白屬于快速進(jìn)化類(lèi)蛋白，在人體多

2、個(gè)組織中都有表達(dá)，包括腫瘤組織。人精囊蛋白可以分為兩種類(lèi)型，即精囊蛋白Ⅰ(semenogelinⅠ，SEMG1)和精囊蛋白Ⅱ(semenogelinⅡ，SEMG2)。在射精時(shí)，精囊蛋白與精液混合，形成精液凝膠，抑制精子向前運(yùn)動(dòng)。目前的研究表明:在機(jī)體內(nèi)，金屬離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合對(duì)控制諸如記憶、學(xué)習(xí)等生理過(guò)程發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，精囊蛋白亦是如此。鋅離子與精囊蛋白結(jié)合后，通過(guò)改變蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而控制精囊蛋白相關(guān)作用的發(fā)揮。除此以外，精子細(xì)

3、胞膜表面的鈣離子泵，目前認(rèn)為與精子活力的變化息息相關(guān)。
　　精囊蛋白必須通過(guò)與精子尾部表面Eppin蛋白相結(jié)合，再與叢生蛋白、乳鐵蛋白形成一種稱(chēng)為EPC的復(fù)合物，從而發(fā)揮其生物學(xué)活性。將重組Eppin蛋白主動(dòng)免疫雄性猿猴后，可以檢測(cè)到特異性抗Eppin抗體，且免疫后78％雄性不育。抗Eppin抗體的結(jié)構(gòu)與SEMG結(jié)構(gòu)非常相似。因此，本研究認(rèn)為，通過(guò)研究SEMG1蛋白結(jié)構(gòu)及其與Eppin相互作用位點(diǎn)，可能為新型免疫避孕疫苗的研究提供

4、依據(jù)。本課題計(jì)劃通過(guò)原核表達(dá)足量可溶性重組蛋白，為下一階段蛋白質(zhì)結(jié)晶與晶體結(jié)構(gòu)解析做準(zhǔn)備，進(jìn)而為候選疫苗研究提供條件。
　　本課題分為以下三個(gè)部分:第一部分:SEMG1與△SEMG1蛋白質(zhì)氨基酸序列分析，運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)蛋白氨基酸序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析、比較;第二部分:構(gòu)建△SEMG1可溶性蛋白質(zhì)的原核表達(dá)體系，探尋重組蛋白最佳表達(dá)載體，大量表達(dá)的最優(yōu)誘導(dǎo)條件以及純化方式等;第三部分:純化后的重組蛋白的功能驗(yàn)證。
　　結(jié)果:

5、1、△SEMG1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中共有5個(gè)α-螺旋，4個(gè)β-折疊片，且分布不規(guī)則;△SEMG1蛋白片段具有較強(qiáng)的抗原性與親水性;△SEMG1結(jié)構(gòu)分析表明相對(duì)SEMG1更適合用于重組目的蛋白表達(dá);2、從多種原核表達(dá)載體及工程菌中（包括帶有sumo標(biāo)簽質(zhì)粒、pet-28b質(zhì)粒、ROSETTA等）中經(jīng)優(yōu)化改良，最終獲得可溶性重組蛋白;3、經(jīng)反復(fù)嘗試，最終獲得了結(jié)合Amylose層析柱、TEV酶過(guò)夜酶切、目的蛋白Ni柱純化以及分子篩純化相結(jié)合的純

6、化方式，并獲得高純度、可溶性目的蛋白;4、純化后的△SEMG1重組蛋白經(jīng)Western blot驗(yàn)證為與理論分子量大小一致的蛋白質(zhì)，且經(jīng)質(zhì)譜分析證實(shí)為△SEMG1;5、純化后的△SEMG1重組蛋白對(duì)精子活力有明顯的抑制效應(yīng)。
　　綜上所述，本研究通過(guò)分析SEMG1蛋白質(zhì)氨基酸序列及其二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，確定其165～281aa，即△SEMG1為研究目標(biāo);在pMal-c2x-TEV載體上成功地插入△SEMG1基因片段，構(gòu)建了可表達(dá)可溶性△