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文檔簡介
1、在抗腫瘤等方面,IL-18具有潛在的應(yīng)用價值。之前關(guān)于重組人IL-18表達(dá)的研究主要是原核表達(dá)系統(tǒng),不僅表達(dá)量低,而且活性低,分離純化也較困難。為此,本文選用畢赤酵母菌GS115為宿主菌,成功構(gòu)建了pPIC9K-rhIL-18表達(dá)載體,從重組畢赤酵母菌中得到能正確表達(dá)的工程菌Pichiapastoris GSll5/hIL-18,然后進(jìn)一步探討其3L罐規(guī)模的發(fā)酵條件、產(chǎn)物純化工藝以及體外的生物學(xué)作用。
本文首先對重組表達(dá)載
2、體pPIC9K-rhIL-18進(jìn)行鑒定,并將其經(jīng)電轉(zhuǎn)化整合到畢赤酵母受體菌GS115的基因組中,再通過基因組PCR鑒定和篩選,MD板篩選單克隆,BMGY培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng),SDS-PAGE和Western Blot蛋白鑒定等檢測,最終得到能JT確表達(dá)的重組菌株。
本文發(fā)現(xiàn)不同的起始誘導(dǎo)菌體密度、溫度、pH、溶解氧體積分?jǐn)?shù)(DO)和甲醇誘導(dǎo)濃度等培養(yǎng)條件均影響3L罐規(guī)模rhIL-18的表達(dá)水平。經(jīng)研究得到最佳表達(dá)條件:一級種子接
3、入1.5LBSM培養(yǎng)基,起始誘導(dǎo)菌體密度為600,發(fā)酵過程中DO保持在20%左右,最佳pH為6.0,誘導(dǎo)溫度23℃,甲醇誘導(dǎo)濃度為0.25%,整個發(fā)酵過程通過發(fā)酵罐控制軟件系統(tǒng)進(jìn)行在線控制和數(shù)據(jù)采集。
本文初步摸索了rhIL-18分離純化的工藝條件,研究結(jié)果顯示,采用低溫離心除去菌體,0.22μm膜過濾,30kD和10kD膜超濾,低溫乙醇結(jié)合等電點沉淀,疏水層析的分離純化方法,可以得到純度在90%左右,收率42%的rhIL
4、-18。
本文通過MTT法和Hoechst33258染色檢測了rhIL-18對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、人肝癌細(xì)胞株QGY-7703、人肝癌細(xì)胞株QSG-7701、人富頸癌細(xì)胞株HeLa和人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的體外生物學(xué)作用,研究發(fā)現(xiàn)rhIL-18均能抑制這五種癌細(xì)胞的活性,并且其抑制程度與rhIL-18的濃度成正比;此外,rhIL-18還能促進(jìn)上述五種細(xì)胞不同程度的凋亡。從而為進(jìn)一步研究rhIL-18的生物學(xué)作用
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