重組人白細(xì)胞介素-18(rhIL-18)的畢赤酵母表達(dá)及其對腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用研究.pdf

1、在抗腫瘤等方面，IL-18具有潛在的應(yīng)用價值。之前關(guān)于重組人IL-18表達(dá)的研究主要是原核表達(dá)系統(tǒng)，不僅表達(dá)量低，而且活性低，分離純化也較困難。為此，本文選用畢赤酵母菌GS115為宿主菌，成功構(gòu)建了pPIC9K-rhIL-18表達(dá)載體，從重組畢赤酵母菌中得到能正確表達(dá)的工程菌Pichiapastoris GSll5/hIL-18，然后進(jìn)一步探討其3L罐規(guī)模的發(fā)酵條件、產(chǎn)物純化工藝以及體外的生物學(xué)作用。
　　 本文首先對重組表達(dá)載

2、體pPIC9K-rhIL-18進(jìn)行鑒定，并將其經(jīng)電轉(zhuǎn)化整合到畢赤酵母受體菌GS115的基因組中，再通過基因組PCR鑒定和篩選，MD板篩選單克隆，BMGY培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，SDS-PAGE和Western Blot蛋白鑒定等檢測，最終得到能JT確表達(dá)的重組菌株。
　　 本文發(fā)現(xiàn)不同的起始誘導(dǎo)菌體密度、溫度、pH、溶解氧體積分?jǐn)?shù)(DO)和甲醇誘導(dǎo)濃度等培養(yǎng)條件均影響3L罐規(guī)模rhIL-18的表達(dá)水平。經(jīng)研究得到最佳表達(dá)條件:一級種子接

3、入1.5LBSM培養(yǎng)基，起始誘導(dǎo)菌體密度為600，發(fā)酵過程中DO保持在20％左右，最佳pH為6.0，誘導(dǎo)溫度23℃，甲醇誘導(dǎo)濃度為0.25％，整個發(fā)酵過程通過發(fā)酵罐控制軟件系統(tǒng)進(jìn)行在線控制和數(shù)據(jù)采集。
　　 本文初步摸索了rhIL-18分離純化的工藝條件，研究結(jié)果顯示，采用低溫離心除去菌體，0.22μm膜過濾，30kD和10kD膜超濾，低溫乙醇結(jié)合等電點沉淀，疏水層析的分離純化方法，可以得到純度在90％左右，收率42％的rhIL

4、-18。
　　 本文通過MTT法和Hoechst33258染色檢測了rhIL-18對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、人肝癌細(xì)胞株QGY-7703、人肝癌細(xì)胞株QSG-7701、人富頸癌細(xì)胞株HeLa和人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的體外生物學(xué)作用，研究發(fā)現(xiàn)rhIL-18均能抑制這五種癌細(xì)胞的活性，并且其抑制程度與rhIL-18的濃度成正比;此外，rhIL-18還能促進(jìn)上述五種細(xì)胞不同程度的凋亡。從而為進(jìn)一步研究rhIL-18的生物學(xué)作用