10種蟲媒病毒TaqMan一步法單重-多重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法的建立及探索.pdf

1、目的：分析各種蟲媒病毒的公共衛(wèi)生學(xué)意義及其在貴州的傳播風(fēng)險(xiǎn)，篩選出部分病毒作為監(jiān)測(cè)對(duì)象，并基于TaqMan RT-PCR技術(shù)，建立出適合貴州省的快速、靈敏、特異的蟲媒病毒檢測(cè)方法。為貴州省重要病媒生物防控及病原檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)建設(shè)提供技術(shù)支持。
　　方法:
　　1.查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定需要監(jiān)測(cè)的蟲媒病毒后，通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得各病毒的全基因序列，使用Bioedit軟件對(duì)各病毒的全基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，找到高度保守區(qū)域，利用N

2、CBI blast及DNAStar中primer select等軟件輔助手動(dòng)設(shè)計(jì)引物及TaqMan探針，并對(duì)多重組合中的多對(duì)引物探針的相互影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　2.運(yùn)用體外轉(zhuǎn)錄方法合成靶基因的RNA模板，并以制備的RNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行單重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，評(píng)價(jià)各體系的靈敏度及重復(fù)性；將所有病毒的引物-探針對(duì)之間做交叉反應(yīng)試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)各體系的特異性。
　　3.在單重?zé)晒舛縍T-PCR的基礎(chǔ)上，查閱文獻(xiàn)，

3、根據(jù)病毒所致疾病類型與種屬分類情況將10種病毒初步分成三組，根據(jù)組合信息，在同一體系中同時(shí)加入多種引物探針，對(duì)多重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行摸索，并通過(guò)對(duì)退火溫度、引物探針濃度等條件的摸索來(lái)改善多重體系中非特異條帶的情況。
　　4.根據(jù)病毒TaqMan探針的標(biāo)記，將所有病毒做交叉實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出可行的雙重?zé)晒舛縍T-PCR組合。
　　5.針對(duì)篩選出的兩組可行組合，利用RNA標(biāo)準(zhǔn)

4、品進(jìn)行雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，評(píng)價(jià)各體系的靈敏度及重復(fù)性；利用體外轉(zhuǎn)錄合成的病毒 RNA和感染DENV-2的蚊蟲樣本RNA對(duì)方法的實(shí)用性及特異性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果：
　　1.確定10種黃病毒科黃病毒屬中影響較嚴(yán)重的蟲媒病毒為主要監(jiān)測(cè)對(duì)象。
　　2.制備了10種病毒的RNA標(biāo)準(zhǔn)品。
　　3.繪制了10種蟲媒病毒單重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Ct值與起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)相關(guān)

5、性都達(dá)到0.99以上,擴(kuò)增效率在87.20％～102.00%之間。各體系的靈敏度、重復(fù)性、特異性檢測(cè)結(jié)果表明：靈敏度在101～102copies/μL，組內(nèi)變異系數(shù)小于3%；10種病毒的引物-探針對(duì)之間做交叉反應(yīng)驗(yàn)證，各引物-探針對(duì)與其他病毒均無(wú)明顯擴(kuò)增。
　　4.建立了DENV-2/DENV-3和JEV/WNV兩組雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Ct值與起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)相關(guān)性都達(dá)到0.99以上，擴(kuò)增效率在83.6

6、%-98.06%之間。兩組雙重實(shí)時(shí)熒光體系的靈敏度、特異性、重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果表明：靈敏度在102-103copies/μL之間，組內(nèi)變異系數(shù)最大為3.00%；利用體外轉(zhuǎn)錄的病毒RNA樣本和蚊蟲樣本對(duì)建立的2組雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的特異性進(jìn)行初步評(píng)價(jià),結(jié)果表明：DENV-2/DENV-3的雙重實(shí)時(shí)熒光體系能特異的檢測(cè)出被DENV-2感染上的蚊子。運(yùn)用體外轉(zhuǎn)錄的病毒 RNA對(duì)建立的兩組雙重實(shí)時(shí)熒光方法進(jìn)行檢測(cè)，僅DENV-2、DENV

7、-3、JEV、WNV四種病毒RNA被檢測(cè)到。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立了DENV-1/DENV-2/DENV-3/DENV-4、JEV、WNV、TEBV、MVEV、KFDV、YFV這10種蟲媒病毒的單重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR體系，經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)，體系的靈敏度均達(dá)到102copies/μL，擴(kuò)增效率高，重復(fù)性及特異性好。
　　2.成功建立了DENV-2/DENV-3/、JEV/WNV這4種蟲媒病毒的雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-

8、PCR檢測(cè)體系，經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)，除DENV-2/JEV靈敏度只達(dá)到103copies/μL外，體系的靈敏度均達(dá)到102copies/μL，仍具有較高的靈敏度。體系的擴(kuò)增效率高，重復(fù)性及特異性好。后續(xù)研究需對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，希望能夠提高反應(yīng)的靈敏度與擴(kuò)增效率。希望以本研究為基礎(chǔ)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中能達(dá)到對(duì)蟲媒病毒的多重檢測(cè)。
　　3.利用體外轉(zhuǎn)錄的病毒RNA、蚊蟲樣本對(duì)所建立的JEV/WNV、DENV-2/DENV-3雙重實(shí)時(shí)熒光定量