RPN4的生理功能及其降解研究.pdf

1、泛素-蛋白酶體降解系統(tǒng)一直是胞內(nèi)用來清除異常的蛋白質(zhì)和選擇性降解各種生化過程中調(diào)控蛋白的執(zhí)行者，它可以降解錯誤折疊的蛋白也可以及時更新細(xì)胞周期過程中的調(diào)控因子，對細(xì)胞的各種生化過程進(jìn)行精密的調(diào)節(jié)，從而可以將胞內(nèi)的蛋白質(zhì)總量維持在一個相對恒定的水平，保證正常生命活動的規(guī)律性[1-3]。 芽殖酵母的RPN4(RegulatingParticleNoneATPase-4)基因，亦稱SON1和UFD5，最開始是作為溫度敏感株的抑制子S

2、uppressor被發(fā)現(xiàn)的，即PRN4的失活突變可以恢復(fù)sec63-101在限制溫度下的生長缺陷。后來發(fā)現(xiàn)，RPN4基因的突變還可以穩(wěn)定泛素融合底物(UFDpathway的底物)UB-Vβgal，在不影響其多聚泛素化的情況下，阻礙26S蛋白酶體對它的降解，因此亦被命名為UFD5。 以前的研究表明在蛋白酶體的32個亞基中有26個基因的上游啟動子區(qū)域含有PACE(Proteasome-associatedcontrolelemen

3、t)序列，而RPN4正是這段順式轉(zhuǎn)錄元件的反式轉(zhuǎn)錄因子，并且其自身的降解也必須靠蛋白酶體來實現(xiàn)。這暗示了一種負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制的存在：RPN4上調(diào)蛋白酶體亞基的水平，上調(diào)的亞基組裝成有活性的蛋白酶體又反過來降解自身的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而將其下游轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物——蛋白酶體亞基維持在一個相對恒定的水平，保證細(xì)胞正常的生命活動。 本論文的結(jié)果提供了直接的證據(jù)證明負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制的存在，首先在兩種不同的蛋白酶體活性受損的菌株內(nèi)觀察到RPN4蛋白的半

4、衰期大大延長，穩(wěn)定性明顯升高，隨后檢測受其調(diào)控的下游蛋白酶體亞基的水平，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，在蛋白酶體活性受損的突變型酵母菌株內(nèi)其各個亞基的豐度都有大幅度提高，Northern檢測證實這種升高是由轉(zhuǎn)錄水平的增強(qiáng)引起的并且隨著RPN4穩(wěn)定性的增加而增加。這些結(jié)果都表明在蛋白酶體活性受損的菌株內(nèi)由于對RPN4的降解能力減弱，增加了RPN4在細(xì)胞內(nèi)的豐度，上調(diào)了其各個亞基的轉(zhuǎn)錄水平，從而在數(shù)量上對胞內(nèi)受損的蛋白酶體給與補充，使其達(dá)到新的動態(tài)平衡

5、，維持細(xì)胞正常的蛋白酶體活力水平。之后我們做了大量的酵母菌株表型測試試驗，結(jié)果與預(yù)想的一致，在蛋白酶體單亞基突變造成的活性受損菌株中酵母的存活率與生長速度都與野生型相差無幾，但是當(dāng)在實驗中同時損傷蛋白酶體的活性并去除RPN4介導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制之后，菌株就表現(xiàn)出強(qiáng)烈的合成致死效果，存活率大大降低，生長速度也十分緩慢，可見在RPN4缺失的情況下，受損的蛋白酶體無法在數(shù)量上得到補給，給菌株的生長帶來了毀滅性的災(zāi)害。此外，為了研究蛋白酶體各個

6、亞基對上游轉(zhuǎn)錄因子RPN4的應(yīng)答，我們選用位于20S核心顆粒的不同亞基做標(biāo)記，正是這個偶然的機(jī)會使我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用目前普遍使用的純化26S蛋白酶體的方法來做體外活性實驗時，其蛋白酶體的活性在純化過程中就已經(jīng)受到了損傷，從表型上看，在RPN4缺失的情況下，26S蛋白酶體的表達(dá)量雖然不如野生型，但是仍然可以足夠維持酵母細(xì)胞的存活和生長，如果同時在蛋白酶體亞基PRE2的末端加上TAG，就嚴(yán)重影響了菌株的存活率和生長速度，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的合成致死。說

7、明由末端加上TAG的PRE2組裝的26S蛋白酶體的活性已經(jīng)大大不如野生型，這些結(jié)果都為將來的蛋白酶體體外活性實驗提供了很好的指導(dǎo)。由于最新的報道表明，26S蛋白酶體以及一些RPN4的下游基因都參與了DNA的修復(fù)過程，這種相關(guān)性使我們想進(jìn)一步探求在DNA損傷試劑的作用下，RPN4-蛋白酶體負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制是否在整個DNA復(fù)制后修復(fù)過程中起了關(guān)鍵的作用。實驗結(jié)果證明，在MMS作用之后，蛋白酶體的活性有所損傷，但是其在細(xì)胞內(nèi)的豐度明顯增加，并且

8、這種增加表現(xiàn)出強(qiáng)烈的RPN4依賴性。有可能在DNA損傷試劑作用之后，很多壓力敏感的蛋白由于表現(xiàn)異常，無法形成正確的構(gòu)象執(zhí)行功能，需要被26S蛋白酶體降解。而RPN4正是介導(dǎo)了在此應(yīng)激狀態(tài)下蛋白酶體總量最大程度的提高。 鑒于酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體的總量始終受以RPN4為核心的負(fù)反饋機(jī)制的調(diào)控，所以對轉(zhuǎn)錄因子RPN4降解途徑的研究就顯得尤為重要。之前的工作表明，RPN4存在兩條相互獨立且蛋白酶體依賴的降解途徑，一條是與底物的多聚泛素化

9、有關(guān)的泛素依賴性降解，而另一條則是與N端的前10個氨基酸有關(guān)的泛素非依賴性降解。為了將底物的這兩條降解途徑分開，我們在已經(jīng)報道的15種E3缺失突變的酵母菌株中表達(dá)了去除其泛素非依賴性降解信號的底物——N端缺失的RPN4，結(jié)果顯示只有在ubr2△的酵母菌株中才能夠檢測到底物的存在，相應(yīng)的Pulse-chase試驗結(jié)果也表明，UBR2的缺失致使細(xì)胞中的底物蛋白完全穩(wěn)定了。之后，當(dāng)我們用全長的RPN4做同樣的實驗時也得到了類似的結(jié)果，雖然全長

10、蛋白的泛素非依賴性降解途徑仍在繼續(xù)，但是由于其泛素依賴性降解途徑的阻斷，蛋白底物的半衰期大大延長，穩(wěn)定性有明顯的提高。據(jù)此推測UBR2極有可能參與了RPN4的多聚泛素化降解過程。根據(jù)以前酵母雙雜交實驗的報道，UBR2可以與N-endrule信號通路的E2-RAD6相互結(jié)合，因此我們推測RAD6極有可能在RPN4的泛素依賴性降解途徑中也行使E2的功能。從理論上講，含有RING結(jié)構(gòu)域的E3可以作為媒介將E2與底物蛋白在空間上聚攏在一起，以最

11、優(yōu)化的方式使底物直接從E2獲得Ubiquitin。為了證實以上對RAD6蛋白功能的推測，我們做了免疫共沉淀實驗，結(jié)果表明RAD6和底物RPN4都可以與UBR2發(fā)生特異性結(jié)合，而且在RAD6△的菌株內(nèi)，N端缺失的RPN4蛋白泛素依賴性降解途徑也被完全阻斷了。這些實驗結(jié)果都從不同的側(cè)面向我們描繪出細(xì)胞內(nèi)RPN4多聚泛素化反應(yīng)的基本過程，為了證實以上所有對RPN4降解途徑的推測，我們在體外重建了整個泛素化反應(yīng)過程，發(fā)現(xiàn)只有在E1，RAD6，U

12、BR2，RPN4都存在的情況下，才可以看到多聚泛素鏈形成。說明底物RPN4的多聚泛素化反應(yīng)確實需要特異的E3-UBR2的參與。 由于蛋白酶體的豐度和活性大小與酵母細(xì)胞的生長狀況密切相關(guān)，而RPN4又是蛋白酶體亞基轉(zhuǎn)錄所必需的反式轉(zhuǎn)錄因子，所以酵母細(xì)胞內(nèi)UBR2的缺失必然會導(dǎo)致RPN4的降解受到抑制，在細(xì)胞內(nèi)的豐度增加，從而進(jìn)一步促進(jìn)下游26S蛋白酶體的轉(zhuǎn)錄，提高其在細(xì)胞內(nèi)的整體水平。為了研究RPN4的累積對酵母細(xì)胞生長的影響，

13、我們做了菌株的表型測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是否在野生型還是在UBR2缺失型的酵母中過量表達(dá)RPN4，菌株的生長速度和存活率都沒有明顯的差異。推測可能是因為泛素非依賴性降解途徑的存在，使得由UBR2缺失而穩(wěn)定的RPN4又很快在細(xì)胞內(nèi)被26S蛋白酶體降解，所以無法發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用；又或者酵母細(xì)胞本身就可以在正常的生長條件下忍受高于普通水平的RPN4和蛋白酶體。之后，為了進(jìn)一步確證在蛋白酶體活性受損的情況下，累積的RPN4是否會對酵母細(xì)胞的生長產(chǎn)

14、生影響。我們在蛋白酶體活性受損以及同時伴有UBR2缺失的酵母菌株內(nèi)過量表達(dá)RPN4，發(fā)現(xiàn)其生長速度和存活率都明顯低于同源的野生型菌株，并且這種表型的缺陷呈現(xiàn)出很強(qiáng)的RPN4劑量依賴性。相比之下，在同樣背景的酵母菌株內(nèi)過量表達(dá)喪失了轉(zhuǎn)錄活性的RPN4(C477A)，由UBR2缺失而穩(wěn)定的RPN4卻沒有對菌株的表型產(chǎn)生任何影響。所有這些結(jié)果都證明在蛋白酶體活性受損的菌株內(nèi)UBR2缺失引起的RPN4蛋白的累積對菌株生長的毒性，有可能是由其下游