Id1基因表達與垂體腺瘤的侵襲性研究.pdf

1、目的：研究Id1蛋白在侵襲性垂體腺瘤組織中的表達及意義，構(gòu)建代號為NQ-04的原代侵襲性垂體腺瘤細胞株，探討siRNA轉(zhuǎn)染后NQ-04細胞侵襲性的改變，從而為臨床診斷和治療侵襲性垂體腺瘤提供新的理論和實驗依據(jù)。
　　方法：⑴Western blot分別檢測Id1蛋白在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤中的表達。我們從本院收集的45例術(shù)中新鮮冰凍垂體腺瘤中隨機選取15例侵襲性垂體瘤和15例非侵襲性垂體瘤提取全蛋白，提取的總蛋白，加入2xSDS

2、蛋白上樣緩沖液（按1∶1比例），于100℃煮沸5min。Westernblot方法檢測后觀察凝膠圖像，應(yīng)用AdobePhotoshop圖像軟件掃描Western blot凝膠圖片，得到相應(yīng)灰度值，分析Id1蛋白在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤中的表達是否有顯著差異。⑵構(gòu)建代號為NQ-04的原代侵襲性垂體腺瘤細胞株。術(shù)中取出垂體腺瘤組織后，在無菌條件下放入PBS溶液中，封口膜封口，置于冰桶中轉(zhuǎn)移至實驗室。通過機械消化和酶消化結(jié)合方法分離細胞。本

3、課題組利用侵性垂體腺瘤新鮮組織樣本原代培養(yǎng)成代號為NQ-04的細胞。⑶siRNA-Id1轉(zhuǎn)染NQ-04細胞。siRNA用無RNA酶H20稀釋成20umol/L，分裝儲存于-20℃。轉(zhuǎn)染時用細胞培養(yǎng)液稀釋，按照2.5∶1比例和lipotaminelTM2000混勻，室溫靜置20min，然后按照不同終濃度加入不含血清的培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)6h后換成含10％血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24-72h。⑷Western blot檢測siRNA-Id1轉(zhuǎn)染后

4、NQ-04細胞中的Id1蛋白表達，檢驗Id1基因沉默效率。⑸移行小室(Transwell)侵襲實驗檢測siRNA轉(zhuǎn)染NQ-04細胞后對其侵襲能力的影響，200倍光鏡下隨機取5個視野計數(shù)膜背面的穿膜細胞，取平均數(shù)。實驗重復3次。
　　結(jié)果：①Id1基因在侵襲性垂體瘤中的表達明顯高于在非侵襲性垂體瘤中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(n=15，t=2.725，p=0.013，p＜0.05)，也同樣進一步提示Id1基因在侵襲性垂體瘤中具有調(diào)節(jié)作

5、用。②Id1蛋白在siRNA-id1轉(zhuǎn)染后的NQ-04細胞中表達顯著減低。③在200倍隨機選取的5個視野下計數(shù)對照組與干擾組細胞數(shù)發(fā)現(xiàn)被siRNA-id1轉(zhuǎn)染的NQ-04細胞組為(40±16.54)，未被siRNA-id1轉(zhuǎn)染的NQ-04細胞組為(67±17.45)，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.972，p=0.016，p＜0.05)。表明轉(zhuǎn)染siRNA靶向干擾Id1后，NQ-04細胞的遷移能力明顯降低。Id1蛋白在siRNA-id1轉(zhuǎn)染后