2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:ZNF580是由本課題組最初通過(guò)LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞克隆得到的一種新的C2H2型鋅指蛋白基因,(Genbank注冊(cè)號(hào):AF184939)。其功能尚不明確,仍在進(jìn)一步研究中,本實(shí)驗(yàn)旨在研究ZNF580基因過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響,以及對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷的修復(fù)作用及其可能的機(jī)制,為闡明ZNF580基因的功能提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
   方法:
   1、構(gòu)建ZNF580過(guò)表達(dá)的慢病毒載體L

2、enti-GFP-ZNF580和空白對(duì)照載體Lenti-null,并對(duì)過(guò)表達(dá)載體測(cè)序證實(shí)構(gòu)建的正確性。
   2、采用酶消化法提取分離大鼠的原代血管平滑肌細(xì)胞,分離出細(xì)胞后用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。并用免疫熒光檢測(cè)血管平滑肌標(biāo)記性抗原SM-α,對(duì)VSMC進(jìn)行鑒定。
   3、取培養(yǎng)3-8代的原代VSMC,分別用Lenti-GFP-ZNF580(實(shí)驗(yàn)組)和Lenti-nu

3、ll(對(duì)照組)進(jìn)行感染,并通過(guò)RT-PCR和Western Blot在基因和蛋白水平鑒定ZNF580的表達(dá)情況。
   4、通過(guò)BrdU摻入實(shí)驗(yàn)分析Lenti-GFP-ZNF580轉(zhuǎn)染組(實(shí)驗(yàn)組)和Lenti-null轉(zhuǎn)染組(對(duì)照組)以及正常VSMC的增殖能力,檢測(cè)ZNF580基因過(guò)表達(dá)后對(duì)VSMC增殖的影響。
   5、利用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lenti-GFP-ZNF580轉(zhuǎn)染組(實(shí)驗(yàn)組)和Lenti-nu

4、ll轉(zhuǎn)染組(對(duì)照組)以及正常VSMC的遷移能力,分析ZNF580基因過(guò)表達(dá)后對(duì)VSMC遷移能力的影響。
   6、應(yīng)用大鼠全基因組芯片分析ZNF580基因過(guò)表達(dá)后VSMC基因表達(dá)譜的變化,并用RT-PCR對(duì)可能與VSMC增殖、遷移及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的的差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。
   7、復(fù)制大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型,損傷局部轉(zhuǎn)染Lenti-GFP-ZNF580(實(shí)驗(yàn)組)和Lenti-null(對(duì)照組),通過(guò)免疫熒光檢測(cè)ZNF58

5、0的表達(dá)水平及表達(dá)部位,利用HE染色觀察各組血管的狹窄情況并通過(guò)免疫組化分析各組PCNA的表達(dá)情況。
   結(jié)果:
   1、成功構(gòu)建ZNF580過(guò)表達(dá)的慢病毒載體Lenti-GFP-ZNF580和空白對(duì)照載體Lenti-null,并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證其序列的正確性。滴度檢測(cè)顯示病毒滴度為1x109UT/ml。
   2、免疫熒光檢測(cè)血管平滑肌標(biāo)記性抗原SM-α,證明成功提取大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞,用不同MOI值(10

6、,50,100)感染VSMC,熒光顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)當(dāng)MOI值為100時(shí),細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到80%以上,因此后續(xù)試驗(yàn)都以MOI值為100轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
   3、BrdU摻入實(shí)驗(yàn)顯示Lenti-GFP-ZNF580轉(zhuǎn)染組(0.095±0.019)比Lenti-null轉(zhuǎn)染組(0.148±0.025)以及正常VSMC組(0.154±0.02)的增殖能力減弱(P<0.05),Lenti-null轉(zhuǎn)染組與正常VSMC組間沒(méi)有差異。

7、   4、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Lenti-GFP-ZNF580轉(zhuǎn)染組(43±7.6)比Lenti-null轉(zhuǎn)染組(82±6.7)以及正常VSMC組(76±8.4)的遷移能力減弱(P<0.05),Lenti-null轉(zhuǎn)染組與正常VSMC組間沒(méi)有差異。
   5、芯片結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Lenti-GFP-ZNF580后VSMC的基因表達(dá)譜發(fā)生廣泛變化,其中變化在2倍以上的共有163個(gè)(降低147個(gè)升高16個(gè)),而變化在1.

8、5倍以上的共有718個(gè)(降低587個(gè)升高131個(gè))。
   6、動(dòng)物模型HE染色結(jié)果顯示Lenti-GFP-ZNF580治療組(中內(nèi)膜比I/M:1.08±0.31)再狹窄率明顯低于Lenti-null(中內(nèi)膜比I/M:2.95±0.43)對(duì)照組(P<0.05)。免疫組化的結(jié)果顯示治療組PCNA的表達(dá)水平也明顯降低。
   結(jié)論:
   1、成功構(gòu)建ZNF580過(guò)表達(dá)的慢病毒載體Lenti-GFP-ZNF580,并

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