鋅指基因ZNF580過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷修復(fù)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:ZNF580是由本課題組最初通過(guò)LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞克隆得到的一種新的C2H2型鋅指蛋白基因，(Genbank注冊(cè)號(hào):AF184939)。其功能尚不明確，仍在進(jìn)一步研究中，本實(shí)驗(yàn)旨在研究ZNF580基因過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，以及對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷的修復(fù)作用及其可能的機(jī)制，為闡明ZNF580基因的功能提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、構(gòu)建ZNF580過(guò)表達(dá)的慢病毒載體L

2、enti-GFP-ZNF580和空白對(duì)照載體Lenti-null，并對(duì)過(guò)表達(dá)載體測(cè)序證實(shí)構(gòu)建的正確性。
　　 2、采用酶消化法提取分離大鼠的原代血管平滑肌細(xì)胞，分離出細(xì)胞后用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％ CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。并用免疫熒光檢測(cè)血管平滑肌標(biāo)記性抗原SM-α，對(duì)VSMC進(jìn)行鑒定。
　　 3、取培養(yǎng)3-8代的原代VSMC，分別用Lenti-GFP-ZNF580（實(shí)驗(yàn)組）和Lenti-nu

3、ll（對(duì)照組）進(jìn)行感染，并通過(guò)RT-PCR和Western Blot在基因和蛋白水平鑒定ZNF580的表達(dá)情況。
　　 4、通過(guò)BrdU摻入實(shí)驗(yàn)分析Lenti-GFP-ZNF580轉(zhuǎn)染組（實(shí)驗(yàn)組）和Lenti-null轉(zhuǎn)染組（對(duì)照組）以及正常VSMC的增殖能力，檢測(cè)ZNF580基因過(guò)表達(dá)后對(duì)VSMC增殖的影響。
　　 5、利用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lenti-GFP-ZNF580轉(zhuǎn)染組（實(shí)驗(yàn)組）和Lenti-nu

4、ll轉(zhuǎn)染組（對(duì)照組）以及正常VSMC的遷移能力，分析ZNF580基因過(guò)表達(dá)后對(duì)VSMC遷移能力的影響。
　　 6、應(yīng)用大鼠全基因組芯片分析ZNF580基因過(guò)表達(dá)后VSMC基因表達(dá)譜的變化，并用RT-PCR對(duì)可能與VSMC增殖、遷移及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的的差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 7、復(fù)制大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型，損傷局部轉(zhuǎn)染Lenti-GFP-ZNF580（實(shí)驗(yàn)組）和Lenti-null（對(duì)照組），通過(guò)免疫熒光檢測(cè)ZNF58

5、0的表達(dá)水平及表達(dá)部位，利用HE染色觀察各組血管的狹窄情況并通過(guò)免疫組化分析各組PCNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、成功構(gòu)建ZNF580過(guò)表達(dá)的慢病毒載體Lenti-GFP-ZNF580和空白對(duì)照載體Lenti-null，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證其序列的正確性。滴度檢測(cè)顯示病毒滴度為1x109UT/ml。
　　 2、免疫熒光檢測(cè)血管平滑肌標(biāo)記性抗原SM-α，證明成功提取大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞，用不同MOI值(10

6、，50，100)感染VSMC，熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)MOI值為100時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到80％以上，因此后續(xù)試驗(yàn)都以MOI值為100轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
　　 3、BrdU摻入實(shí)驗(yàn)顯示Lenti-GFP-ZNF580轉(zhuǎn)染組（0.095±0.019）比Lenti-null轉(zhuǎn)染組（0.148±0.025）以及正常VSMC組（0.154±0.02）的增殖能力減弱(P＜0.05)，Lenti-null轉(zhuǎn)染組與正常VSMC組間沒(méi)有差異。

7、　　 4、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Lenti-GFP-ZNF580轉(zhuǎn)染組（43±7.6）比Lenti-null轉(zhuǎn)染組（82±6.7）以及正常VSMC組（76±8.4）的遷移能力減弱(P＜0.05)，Lenti-null轉(zhuǎn)染組與正常VSMC組間沒(méi)有差異。
　　 5、芯片結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Lenti-GFP-ZNF580后VSMC的基因表達(dá)譜發(fā)生廣泛變化，其中變化在2倍以上的共有163個(gè)（降低147個(gè)升高16個(gè)），而變化在1.

8、5倍以上的共有718個(gè)（降低587個(gè)升高131個(gè)）。
　　 6、動(dòng)物模型HE染色結(jié)果顯示Lenti-GFP-ZNF580治療組（中內(nèi)膜比I/M:1.08±0.31）再狹窄率明顯低于Lenti-null（中內(nèi)膜比I/M:2.95±0.43）對(duì)照組(P＜0.05)。免疫組化的結(jié)果顯示治療組PCNA的表達(dá)水平也明顯降低。
　　 結(jié)論:
　　 1、成功構(gòu)建ZNF580過(guò)表達(dá)的慢病毒載體Lenti-GFP-ZNF580，并