A20基因?qū)Υ笫箢i動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生的影響及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)是治療冠心病的有效手段，但是再狹窄(restenosis，RS)仍是制約這一技術(shù)應(yīng)用的主要問(wèn)題。大量研究證實(shí)，再狹窄的機(jī)制主要由于球囊擴(kuò)張和支架置入時(shí)導(dǎo)致血管壁損傷，引起炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞的增殖和移行。由于血管壁的機(jī)械性損傷所致的炎性和增殖效應(yīng)是造成再狹窄的主要原因，多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、粘附分子等參與其病理生理過(guò)程，單

2、純抑制某種特定的因子并不能完全抑制病灶形成。因此，阻斷由炎癥損傷引起的平滑肌細(xì)胞增殖、分化、遷移等最終共同通路的關(guān)鍵基因成為有效防止再狹窄的研究方向。 基于導(dǎo)管將基因準(zhǔn)確地送至狹窄血管的局部進(jìn)行基因治療是預(yù)防血管再狹窄較有效的方法之一，而選擇合適的基因和載體是基因治療再狹窄的關(guān)鍵之一。 近年來(lái)在細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)了一類新的蛋白質(zhì)，即鋅脂蛋白A20(zinc finger protein A20)，簡(jiǎn)稱A20。

3、A20是NF-κB信號(hào)系統(tǒng)重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，也是防止體內(nèi)炎癥反應(yīng)失控的重要調(diào)節(jié)蛋白。A20的表達(dá)能夠被LPS和TNF等所誘導(dǎo)，是NF-κB信號(hào)系統(tǒng)活化的產(chǎn)物，同時(shí)A20通過(guò)抑制TNF和LPS刺激TNFR-1和TLR4誘導(dǎo)的NF-κB的活化而對(duì)細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。已有研究證實(shí)NF-κB的激活是球囊損傷動(dòng)脈后血管狹窄發(fā)生的重要機(jī)制之一。結(jié)構(gòu)研究顯示，A20既有去泛素活性，又有泛素連接酶活性，是一種重要的泛素調(diào)節(jié)酶，在A20等泛素調(diào)節(jié)酶的

4、作用下泛素調(diào)節(jié)參與了NF-κB前體的處理、NF-κB抑制性結(jié)合蛋白IκB的降解和IkB激酶IKK的活化等主要環(huán)節(jié)，反饋抑制了NF-κB的活化。 一方面由于再狹窄的炎癥機(jī)制及A20調(diào)控炎癥的機(jī)制，另一方面由于NF-KB的激活導(dǎo)致球囊損傷后血管狹窄及A20對(duì)NF-kB活化的負(fù)反饋抑制作用，由此我們選擇A20基因作為再狹窄發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的干預(yù)靶點(diǎn)，運(yùn)用基因治療方法對(duì)體內(nèi)A20的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，深入探討球囊損傷術(shù)后血管內(nèi)膜增生過(guò)程中A20

5、在損傷局部組織中的表達(dá)變化及局部過(guò)表達(dá)．A20對(duì)損傷后內(nèi)膜增生、平滑肌細(xì)胞增殖和表型改變，內(nèi)皮再生及TLR4/NF-kB信號(hào)通路的影響，為進(jìn)一步明確A20對(duì)再狹窄過(guò)程中炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用以及揭示機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制提供必要的理論依據(jù)。 方法： 1．pCAGGS-GFP/A20重組質(zhì)粒的鑒定和大量提取：將獲得的pCAGGS-GFP/A20質(zhì)粒菌保涂Amp抗性的平板后，過(guò)夜培養(yǎng)。挑單菌落于3ml Amp抗性的LB培養(yǎng)基中37℃

6、搖床中過(guò)夜培養(yǎng)，集菌后，進(jìn)行小量質(zhì)粒提取，并使用EcoR V/Sma I進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳。將鑒定好的質(zhì)粒菌保進(jìn)行無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒的大量提取，將質(zhì)粒DNA提取物按適當(dāng)比例稀釋，并測(cè)定濃度。 2．動(dòng)物模型制備和實(shí)驗(yàn)分組，大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)膜球囊剝脫術(shù)用來(lái)建立再狹窄模型：健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠體重350～400g，104只隨機(jī)分為4組(n=26)：假手術(shù)組；模型組(單純損傷組)；對(duì)照組(pC

7、AGGS-GFP+轉(zhuǎn)染試劑組)；治療組(pCAGGS-GFP/A20+轉(zhuǎn)染試劑組)。10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉后，取頸正中切口，鈍性分離左頸總動(dòng)脈，暴露左頸總動(dòng)脈及其分叉處，用顯微血管夾暫時(shí)夾閉左頸總動(dòng)脈近心端及頸內(nèi)動(dòng)脈，將2F Fogarty球囊導(dǎo)管從頸外動(dòng)脈切口插入至左頸總動(dòng)脈，用500μl生理鹽水充盈球囊，來(lái)回抽動(dòng)3次以剝脫頸總動(dòng)脈內(nèi)膜。退出球囊，治療組向損傷血管節(jié)段內(nèi)緩慢注入灌注液(Lipofectamine 2

8、000轉(zhuǎn)染試劑40μl+pCAGGS-GFP/A20質(zhì)粒200μl)，對(duì)照組向損傷血管節(jié)段內(nèi)緩慢注入灌注液(Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑400μl+pCAGGS-GFP質(zhì)粒200μl)局部作用30分鐘。模型組只進(jìn)行球囊損傷術(shù)，假手術(shù)組只進(jìn)行左頸外動(dòng)脈結(jié)扎，不進(jìn)行球囊損傷。術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)根據(jù)不同要求分別處死動(dòng)物。轉(zhuǎn)染后24h取大鼠局部血管進(jìn)行冰凍切片熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)籍以評(píng)估A20在損傷動(dòng)脈壁的轉(zhuǎn)染效率；術(shù)

9、后1 4d病理組織學(xué)方法進(jìn)行內(nèi)膜增生的形態(tài)學(xué)分析；術(shù)后10d溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記技術(shù)評(píng)估血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的增殖指數(shù)；術(shù)后10d免疫組織化學(xué)染色觀察A20、核因子-kB p65(NF-kB p65)、Toll樣受體4(TLR4)在各組大鼠頸總動(dòng)脈中的表達(dá)情況；術(shù)后3d、7d、14d、28d通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、Western-blotting法分別檢測(cè)A20、NF-kB p65、TLR4在頸動(dòng)脈

10、組織的mRNA和蛋白表達(dá)。 3．健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠體重350～400g，36只隨機(jī)分為3組(n=12)：假手術(shù)組；對(duì)照組(pCAGGS-GFP+轉(zhuǎn)染試劑組)；治療組(pCAGGS-GFP/A20+轉(zhuǎn)染試劑組)。球囊損傷后2周伊文思藍(lán)(Evansblue)染色法評(píng)估內(nèi)皮再生情況；術(shù)后3d、7d透射電鏡觀察血管超微結(jié)構(gòu)改變。 4．體外培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞并鑒定，以LPS(20mg/1)作為刺

11、激因素，以不同濃度大黃素(Emodin，EMD)作為干預(yù)因素，通過(guò)MTT和BrdU摻入方法評(píng)估各組VSMC增殖情況，以RT-PCR檢測(cè)A20 mRNA表達(dá)，以Western-blotting法檢測(cè)A20、NF-κB p65蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1．將提取的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-GFP/A20使用EcoR V/Sma Ⅰ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳，質(zhì)粒大小及酶切結(jié)果正確。 2．將pCAGGS

12、-GFP/A20于活體轉(zhuǎn)染至大鼠球囊損傷的頸動(dòng)脈局部，24h后熒光顯微鏡下可見(jiàn)治療組殘存血管內(nèi)膜及中膜有大量綠色熒光分布，證明轉(zhuǎn)染成功。 3．大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后14d模型組和對(duì)照組血管內(nèi)膜顯著增生。A20基因轉(zhuǎn)染可顯著抑制新生內(nèi)膜面積的增加(減少47.8％，P<0.05)和內(nèi)/中膜比值的增加(減少42.9％，P<0.05)。術(shù)后10d治療組VSMC體內(nèi)增殖指數(shù)(BrdU指數(shù))(9.6±2.3％)顯著少于對(duì)照組(26.7±5

13、.1％，P<0.01)。術(shù)后10d治療組血管壁A20免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，NF-κB p65、TLR4免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。術(shù)后3d、7d、14d、28d治療組血管組織A20的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，治療組血管組織NF-κBp65、TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。 4．球囊損傷后2周，pCAGGS-GFP/A

14、20質(zhì)粒轉(zhuǎn)染治療組與對(duì)照組比較，顯示更大面積的內(nèi)皮修復(fù)，由伊文思藍(lán)染色證明。治療組再內(nèi)皮化的面積占最初損傷面積的百分?jǐn)?shù)(73.1±3.7％)顯著大于對(duì)照組(55.6±3.3％，P<0.05)。說(shuō)明A20轉(zhuǎn)染治療組與對(duì)照組比較顯示更大面積的內(nèi)皮修復(fù)。 5．假手術(shù)組大鼠VSMC電鏡下呈典型的“收縮表型”，球囊損傷后7d對(duì)照組VSMC表型發(fā)生明顯改變，呈典型的“合成表型”，損傷后3d對(duì)照組可見(jiàn)合成型細(xì)胞及過(guò)渡型細(xì)胞，治療組術(shù)后7d 。

15、見(jiàn)接近收縮型的VSMC。 6．體外培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈VSMC經(jīng)LPS刺激后，MTT OD值與BrdU摻入OD值均顯著高于空白組。經(jīng)不同濃度EMD干預(yù)結(jié)果顯示隨EMD濃度增大，MTT OD值及BrdU摻入OD值均逐漸變小，其中低劑量組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)，高劑量組與對(duì)照組相比存在顯著性差異(P<0.05)。RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示LPS刺激可使A20mRNA和蛋白以及NF-kB p65蛋白表

16、達(dá)均增加，經(jīng)不同濃度EMD干預(yù)后A20mRNA和蛋白表達(dá)隨EMD濃度遞增而進(jìn)一步增加，NF-kB p65蛋白表達(dá)隨EMD濃度遞增而逐漸減少。 結(jié)論： 1．大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)源性鋅指蛋白A20在局部表達(dá)增加，并具有明顯的時(shí)效性，說(shuō)明損傷情況下，A20表達(dá)增加是機(jī)體的一種重要的內(nèi)源性抗炎保護(hù)效應(yīng)機(jī)制，可能對(duì)于調(diào)控?fù)p傷后適度的炎癥反應(yīng)具有重要意義。 2．大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后局部轉(zhuǎn)染A20基因可獲得鋅指蛋白A20mR

17、NA和蛋白在局部組織細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)。 3．大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后局部轉(zhuǎn)染A20基因可抑制損傷血管內(nèi)膜增生及平滑肌細(xì)胞的增殖，其分子機(jī)制可能通過(guò)其負(fù)反饋抑制了TLR4/NF-kB介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 4．大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后局部轉(zhuǎn)染A20基因可促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮再生，抑制損傷處VSMC表型轉(zhuǎn)化，其分子機(jī)制可能通過(guò)其負(fù)反饋抑制了TLR4/NF-KB介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 5．EMD對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈VSMC增殖