折疊酶DsbA的制備及協(xié)助蛋白質(zhì)體外復(fù)性的研究.pdf

1、如何對富含二硫鍵的包涵體蛋白進(jìn)行高效的體外復(fù)性是重組蛋白生產(chǎn)所面臨的巨大挑戰(zhàn).DsbA是大腸桿菌周質(zhì)胞腔中輔助多種含有二硫鍵的蛋白質(zhì)正確折疊并具有生物學(xué)活性的一種二硫鍵異構(gòu)酶.本文將DsbA質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化后,對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了發(fā)酵和純化的優(yōu)化,然后將制備的重組折疊酶DsbA初步應(yīng)用于模型蛋白溶菌酶的體外復(fù)性之中. 首先,將含編碼dsbA基因的質(zhì)粒pAVD63轉(zhuǎn)化到Ecoli BL21(DE3),目標(biāo)蛋白DsbA獲得了可溶性表達(dá).

2、 然后,利用統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法將生產(chǎn)重組DsbA的發(fā)酵過程進(jìn)行了優(yōu)化.通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)挑選出了對DsbA表達(dá)量影響較大的4個(gè)因素,利用雜合設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并通過擬合得到了響應(yīng)曲面函數(shù),但該函數(shù)的駐點(diǎn)是鞍點(diǎn),因此不具有全局的極值.通過約束優(yōu)化得到了較佳的實(shí)驗(yàn)點(diǎn),在該實(shí)驗(yàn)點(diǎn)下DsbA的表達(dá)量比基本培養(yǎng)條件下提高了50.14﹪. 再次,離心收集細(xì)胞后進(jìn)行超聲波破胞,將細(xì)胞破碎的清液經(jīng)過離子交換層析得到純化的Dsb

3、A.為提高DsbA分離純化的效率、回收率并縮短DsbA的制備周期,對離子交換層析過程利用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)優(yōu)化,考察了pH值、洗脫梯度、初始鹽濃度和上樣量的影響.以DsbA洗脫峰面積為響應(yīng)值,擬合出響應(yīng)面函數(shù),并利用多目標(biāo)規(guī)劃中的功效系數(shù)法綜合考慮以上3個(gè)目標(biāo),得到了較優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件為:20mL Q Sepharose Fast Flow凝膠柱,pH值為8.3,洗脫高鹽含量(B液所占比例)為5.88﹪,初始鹽濃度為16.

4、7mM,上樣量為9.25mL.驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明,得到的DsbA洗脫峰面積為4301.8 mAu·mL,與模型預(yù)測的的相對誤差僅為±2.4﹪.最終純化后可得到377.9±1.74mg DsbA/L發(fā)酵液,蛋白收率為96.8﹪,純度大于95﹪.通過肽質(zhì)量指紋譜分析所得目標(biāo)產(chǎn)物為高純度的DsbA,分子量為23kD. 最后,將DsbA應(yīng)用于模型蛋白溶菌酶的復(fù)性過程中.利用Plakett-Burman設(shè)計(jì)考察了影響復(fù)性后溶菌酶蛋白回收和比活的