分泌型人Klotho基因酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及其毒性與自激活效應(yīng)檢測(cè).pdf_第1頁(yè)
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1、Klotho參與人和動(dòng)物的衰老過(guò)程的調(diào)控,一直是衰老研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題,但是klotho調(diào)控衰老的具體的分子信號(hào)機(jī)制,卻仍然沒(méi)有得到闡明。目前認(rèn)為類似激素的klotho可能是起調(diào)節(jié)衰老作用的主要形式,為了深入研究klotho調(diào)控衰老的分子細(xì)胞機(jī)制,有必要弄清到底是哪一種形式的klotho起關(guān)鍵作用,我們從分泌型klotho入手,擬采用酵母雙雜交系統(tǒng)來(lái)篩選與之相互作用的蛋白,并進(jìn)一步分析它如何調(diào)控下游靶基因及相關(guān)信號(hào)通路。
  運(yùn)用P

2、CR方法從pcDNA3.1-KL(secreted)質(zhì)粒中擴(kuò)增5’端高GC含量的分泌型人Klotho基因片段(hsKL),并克隆入pMD18-T載體,測(cè)序鑒定發(fā)現(xiàn),除了兩個(gè)無(wú)義突變外,序列正確。將相應(yīng)片段克隆入酵母雙雜交載體pGBKT7中。鑒定序列正確后,用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化酵母菌AH109,在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上觀察轉(zhuǎn)化菌株的生長(zhǎng)狀況,檢測(cè)誘餌蛋白對(duì)酵母AH109有無(wú)細(xì)胞毒性及對(duì)報(bào)告基因有無(wú)激活作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),pGBKT7-hsKL轉(zhuǎn)化酵母感

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