HPV18E6酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建與檢測.pdf

1、目的：利用酵母雙雜交系統(tǒng)，構(gòu)建人HPV18E6蛋白酵母雙雜交體系中的誘餌質(zhì)粒，對其進(jìn)行鑒定，并檢測該誘餌質(zhì)粒在AH109酵母中的表達(dá)，以及酵母細(xì)胞有無毒性作用和自激活作用。為應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與HPV18 E6的相互作用蛋白奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 方法：培養(yǎng)宮頸腺癌細(xì)胞株Hela，常規(guī)提取細(xì)胞總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用PCR擴(kuò)增HPV18 E6基因cDNA中編碼完整開放閱讀框的基因片段，純化后用 EcoRI、BamH

2、Ⅰ雙酶切HPV18 E6和酵母表達(dá)載體pGBKT7，回收產(chǎn)物并連接，重組質(zhì)粒命名為pGBKT7-HPV18E6，用酶切驗證重組質(zhì)粒的正確性并通過測序檢查質(zhì)粒重組后序列有無變化。用醋酸鋰法(Li-Ac)將序列正確的重組質(zhì)粒pGBKT7-HPV18 E6轉(zhuǎn)入AH109 酵母菌株，在缺陷性培養(yǎng)基上觀察pGBKT7-HPV18 E6在酵母菌AH109中的表達(dá)，檢測誘餌質(zhì)粒有無毒性作用和單倍體及二倍體自激活功能。
　　 結(jié)果：擴(kuò)增DNA片

3、段約為650bp，大小正確，擴(kuò)增后的HPV18 E6基因片段與pGBKT7載體定向重組，克隆重組質(zhì)粒pGBKT7-HPV18E6酶切后顯示的酶切圖譜與預(yù)期相同，測序結(jié)果表明序列正確，融合區(qū)域的讀碼框正確。誘餌載體pGBKT7-HPV18 E6轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞AHl09中，轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒和pGBKT7空載體的酵母菌都能在SD/-Trp/X-α-gal 平板上長出白色菌落，在SD/-His/-Trp/X-α-gal，SD/-Ade/-T

4、rp/X-α-gal平板上不能生長，兩種酵母菌在SD/Trp 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后，菌液的OD600值分別為0.98和0.99，說明AH109[pGBKT7-HPV18E6]轉(zhuǎn)化成功，對酵母菌株AH109 無毒性且不具有自主激活報告基因的功能。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了在酵母細(xì)胞中表達(dá)正確，并對酵母細(xì)胞無毒性作用且無自主激活報告基因功能的誘餌表達(dá)載體pGBKT7-HPV18E6，該載體可作為酵母雙雜交系統(tǒng)中的“誘餌”，該誘餌