乙型肝炎病毒前s區(qū)不同片段在酵母雙雜交系統(tǒng)中的表達(dá)及對報(bào)告基因激活作用的檢測

1、<p>　　乙型肝炎病毒前S區(qū)不同片段在酵母雙雜交系統(tǒng)中的表達(dá)及對報(bào)告基因激活作用的檢測</p><p>　　作者：張偉　劉新平　張景　藥立波　陳常慶 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 肝炎病毒 </p><p>　　關(guān)鍵詞: 肝炎病毒，乙型;酵母菌;雜交;基因，報(bào)告 </p><p>　　摘 要:目的 用含乙型肝炎病毒（HB

2、V）前S區(qū)不同大小的cDNA片段構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體，并檢測其表達(dá)產(chǎn)物對酵母細(xì)胞有無毒性作用及對報(bào)告基因有無激活作用. 方法 PCR擴(kuò)增含HBV前S區(qū)不同大小的cDNA片段，分別克隆入pUC19質(zhì)粒，經(jīng)測序正確后，再分別亞克隆入酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7中.將重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母菌AH109，檢測其表達(dá)產(chǎn)物在酵母細(xì)胞中對報(bào)告基因有無激活作用. 結(jié)果 成功獲得含HBV前S區(qū)不同大小的cDNA片段，HBV前S區(qū)不同片段所表達(dá)的蛋白對酵

3、母菌AH109無毒性，但是對報(bào)告基因均有激活作用. 結(jié)論 不能利用酵母雙雜交Gal4系統(tǒng)3來研究與HBV前S區(qū)相互作用的蛋白;證實(shí)了HBV前S區(qū)不同片段所表達(dá)的蛋白的自激活功能，為進(jìn)一步研究乙型肝炎病毒致病機(jī)制打下了基礎(chǔ). </p><p>　　Keywords:hepatitis B virus;yeasts;hybridization;genes，reporter </p><p>

4、　　Abstract:AIM To construct the bait vector with different sizes of HBV PreS region in yeast two-hybrid system，then assay whether its expression product can affect the growth of yeast cell and activate the reporter genes

5、.METHODS The cDNA fragments encoding different sizes of HBV PreS region were amplified by PCR，and subsequently they were cloned into pUC19.After verified by sequencing，they were sub-cloned into the bait vector pGBKT7of y

6、east two-hybrid sys-tem.Furthermore，these recombinant plasmids</p><p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　HBV屬嗜肝脫氧核糖核酸病毒.其吸附、入侵肝細(xì)胞，是感染肝細(xì)胞并引起病變的第一步，病毒對細(xì)胞的感染常以病毒分子吸附于宿主細(xì)胞表面為先導(dǎo)，即病毒的囊膜蛋白（或無包膜病毒的衣殼蛋白

7、）與細(xì)胞表面相應(yīng)的病毒受體分子結(jié)合.這一過程常常成為決定病毒親嗜范圍與發(fā)病機(jī)制的主要因素［1］ .通過這一途徑研究HBV嗜肝機(jī)制及發(fā)病機(jī)制正得到廣泛開展.HBV表面抗原前S區(qū)具有豐富的生物學(xué)功能和較強(qiáng)的免疫源性，前S區(qū)與HBV對肝細(xì)胞的感染、病毒復(fù)制及病毒顆粒的裝配密切相關(guān)，是HBV重要的保護(hù)性抗原.為了進(jìn)一步研究HBV前S區(qū)病毒吸附蛋白及其相應(yīng)受體的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性，我們運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)來釣取與前S區(qū)不同大小的片段相互作用的蛋白，以

8、期得到其受體基因，并研究其功能，為有效的預(yù)防和治療乙型肝炎開辟新的途徑［2］ . </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 材料 ①質(zhì)粒和菌株 克隆有HBV S區(qū)全長cDNA的質(zhì)粒pcDNA3.0-PreS+S由第四軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室尹文博士惠贈(zèng).表達(dá)載體pGBKT7，AH109酵母菌種由第四軍醫(yī)大學(xué)遺傳學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教

9、研室韓驊教授惠贈(zèng).質(zhì)粒pUC19由本教研室保存.②主要試劑和儀器 PCR試劑盒、DNA重組所用的各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶均購自Gibco公司.DNA電泳膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程公司.酵母培養(yǎng)試劑購自Clontech公司. </p><p><b>　　1.2 方法 </b></p><p>　　1.2.1 PCR擴(kuò)增 克隆編碼前S蛋白不同編碼區(qū)的

10、引物1:5’-CGGAATTCGCAGCTGCAATGGG-AGGTTGGTCT-3’;引物2:5’-CGGGATCCGTT-CGGTGCAGGGTC-3’;引物3:5’-CGGGATCCC-TAGGCCTGAGGATGACTGTC-3’;引物4:5’-CGGAATTCCCTCTGGGATTCTTTCCC-3’.以pcDNA3.0-PreS+S質(zhì)粒為模板，用引物1和引物2擴(kuò)增PreS全長cDNA，1和3擴(kuò)增PreS1 全長cDNA，4和

11、3擴(kuò)增缺失了N端1～20aa的PreS1 的cDNA［命名為PreS1 （t）］.PCR反應(yīng)條件為:94℃30s，55℃60s，72℃60s，30個(gè)循環(huán). </p><p>　　1.2.2 PCR產(chǎn)物克隆及鑒定 純化的PCR產(chǎn)物用EcoR1和BamHI雙酶切，定向克隆入pUC19質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進(jìn)行藍(lán)白篩選.酶切鑒定出含插入片段的陽性克?。鄯謩e命名為pUC19-PreS，pUC19-PreS1 ，p

12、UC19-PreS1 （t）］，然后進(jìn)行序列分析. </p><p>　　1.2.3 構(gòu)建及鑒定誘餌載體 用EcoR1，BamHI酶切pUC19-PreS，PreS1 ，PreS1 （t）和表達(dá)載體pG-BKT7，回收PreS，PreS1 ，PreS1 （t）及pGBKT7載體片段，載體片段與各插段分別連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α.經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析，含正確插段的克隆分別命名為pGBKT7-PreS，pGBKT7

13、-PreS </p><p>　　1 ，pG-BKT7-1 （t）. </p><p>　　1.2.4 制備酵母感受態(tài)細(xì)胞 挑取幾個(gè)酵母菌AH109克隆，接種于50mL YPDA液體培養(yǎng)基中，于30℃以250r min-1 振蕩培養(yǎng)16～18h，至A600nm &gt;1.5.將上述新鮮培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于300mL YPDA液體培養(yǎng)基中，使A600nm =0.2～0.3，再于30℃以2

14、50r min-1 振蕩培養(yǎng)至A600nm =0.4～0.5（約3h）.在室溫下將培養(yǎng)液以5000r min-1 離心5min.棄上清，加 15～25mL去離子水重懸沉淀，洗滌酵母細(xì)胞.再離心取沉淀，用1.5mL1×TE/LiAc溶液重懸，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞. </p><p>　　1.2.5 轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞 在1.5mL微量離心管中，加入已構(gòu)建好的誘餌載體0.1μg，鯡魚精DNA0.1mg和0.

15、1mL酵母感受態(tài)細(xì)胞.混勻后加入0.6mL PEG/LiAc溶液.在30℃以200r min-1 振蕩培養(yǎng)30min，加入70mL DMSO后混勻，在42℃水浴15min，冰浴2min，5000r min-1 離心5s，去上清，以0.5mL1×TE重懸細(xì)胞后，鋪于SD/-Trp平板.于30℃培養(yǎng)36h左右，直至帶有誘餌載體的酵母克隆長出. </p><p>　　1.2.6 蛋白表達(dá)的檢測 </p&

16、gt;<p>　　1.2.6.1 酵母全菌蛋白的抽提 挑取幾個(gè)已轉(zhuǎn)化的酵母菌在5mL SD/-Trp培養(yǎng)液震蕩培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接于50mL SD/-Trp培養(yǎng)液，在30℃以230r min-1 震蕩培養(yǎng)至A600nm =0.4～0.6.在4℃以1000r min-1 離心收菌.將菌體置于液氮中凍存.以60℃的裂解緩沖液（8尿素，50g L-1 SDS，40mmol L-1 Tris-HCl pH6.8，0.1mmol L

17、</p><p>　　-1 EDTA，0.4g L-1 溴酚藍(lán).β-巰基乙醇、PMSF，蛋白酶抑制劑在臨用前加入）200μL融解菌體，混勻后加入0.2g玻璃珠，70℃孵育10min，劇烈混旋1min，在4℃以5000r min-1 離心5min.上清轉(zhuǎn)移至一新的Eppendorf管備用.沉淀在100℃水浴5min，再劇烈混旋1min，4℃以5000r min-1 離心5min后，上清轉(zhuǎn)移至上述的Eppendorf

18、管內(nèi)，100g L-1 SDS-PAGE電泳分析. </p><p>　　1.2.6.2 Western印跡實(shí)驗(yàn) 酵母全菌蛋白經(jīng)100g L-1 SDS-PAGE電泳，以100V，45min將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，室溫封閉2h，然后與1 500稀釋的HRP標(biāo)記的抗HBsAg37℃溫育2h，用TTBS（含1g L-1 Triton-X100的TBS）室溫洗膜3次，在含有H2 O2 和DAB的顯

19、色緩沖液（Tris-HCl100mmol L-1 ，pH7.4，H </p><p>　　2 O2 100mmol L-1 ，DAB50mmol L-1 ）中室溫顯色. </p><p>　　1.2.7 報(bào)告基因表達(dá)的檢測 </p><p>　　1.2.7.1 HIS3報(bào)告基因表達(dá)的檢測 用無菌牙簽隨機(jī)挑取酵母菌單個(gè)克隆，分別劃線于有Trp，Ura，His，Le

20、u營養(yǎng)缺陷的SD平板上，于30℃培養(yǎng)36h，觀察酵母菌的生長情況. </p><p>　　1.2.7.2 LacZ報(bào)告基因表達(dá)的檢測 ①采用β-半乳糖苷酶印膜法檢測LacZ報(bào)告基因的表達(dá).用無菌牙簽隨機(jī)挑取酵母單個(gè)克隆，點(diǎn)樣于硝酸纖維素濾膜上.將帶有酵母克隆的濾膜在液氮中迅速冷凍5s后，置于室溫裂菌.將點(diǎn)有菌體的濾膜面朝上，放在另一張同樣大小浸有Z buffer/X-gal的Whatman1# 濾紙上，趕盡氣泡，

21、于30℃孵育30min～8h，觀察顏色變化.②采用誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母菌AH109后鋪SD/-Trp/X-a-gal平板檢測LacZ報(bào)告基因的表達(dá).將誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母菌AH109后鋪SD/-Trp/X-a-gal平板，30℃培養(yǎng)36h，觀察平板上菌落顏色變化. </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　2.1 前S區(qū)基因不同大小片段編碼區(qū)的擴(kuò)增

22、 以質(zhì)粒pcDNA3.0-PreS+S為模板，在50μL反應(yīng)體系中，按Gibco公司PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR反應(yīng).分別取擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，在10g L-1 瓊脂糖凝膠中電泳，可見擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的cDNA片段（Fig1）.其中PreS大小為522bp，PreS1 大小為357bp，PreS1 （t）大小為297bp. </p><p><b>　　圖1 略 </b></p>

23、;<p>　　2.2 重組pUC19┐PreS，PreS1 ，PreS1 （t）質(zhì)粒的酶切鑒定及序列分析 用EcoR1，BamHI對pUC19-PreS，PreS1 ，PreS1 （t）重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定（Fig2）.鑒定正確的pUC19-PreS，PreS1 ，PreS1 （t）重組質(zhì)粒分別作正反向測序，序列分析表明，所擴(kuò)增的前S基因序列與登錄的HBV adr亞型的前S基因序列完全一致. </p>&l

24、t;p>　　2.3 重組pGBKT7┐PreS，PreS ，PreS1 （t）質(zhì)粒的酶切分析 分別用EcoR1，BamHI將不同大小的前S基因片段從重組質(zhì)粒pUC19-PreS，PreS1 ，PreS1 （t）亞克隆入pGBKT7載體，重組質(zhì)粒pGBKT7-PreS，PreS1 ，PreS1 （t）的酶切鑒定結(jié)果見Fig3. </p><p>　　圖2 － 圖5 略 </p><p

25、>　　2.6 LacZ報(bào)告基因表達(dá)的檢測 將pCL1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入AH109作為陽性對照，將pGBKT7-53和pG-ADT7-T質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入AH109作為另一陽性對照，將pGBKT7-Lams和pGADT7-T質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入AH109作為陰性對照，用β-半乳糖苷酶印膜法，來檢測含pGBKT7-PreS質(zhì)粒的AH109酵母細(xì)胞內(nèi)LacZ報(bào)告基因的表達(dá)情況.Fig6是3種酵母細(xì)胞的顯色結(jié)果.可見LacZ報(bào)告基因被不同大小片段的前S蛋白激

26、活. </p><p><b>　　圖6 略 </b></p><p>　　將誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母菌AH109后鋪SD/-Trp/X-a-gal平板檢測LacZ報(bào)告基因的表達(dá)情況.當(dāng)LacZ報(bào)告基因被激活時(shí)β-半乳糖苷酶大量表達(dá)，活性增高，在X-a-gal存在時(shí)，菌落顯深藍(lán)色，且擴(kuò)散面積較大.說明β-半乳糖苷酶活性顯著增強(qiáng).Fig7是前S基因的3種酵母細(xì)胞在SD/-Trp

27、/X-a-gal平板的顯色結(jié)果.可見LacZ報(bào)告基因被不同結(jié)構(gòu)域的前S蛋白強(qiáng)烈激活. </p><p><b>　　圖7 略 </b></p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　HBV病毒吸附蛋白存在于病毒包膜的3個(gè)相關(guān)蛋白即大蛋白（LHBs）、中蛋白（MHBs）和主蛋白（SHBs）中，這些蛋白質(zhì)

28、C端有相同的序列，其中主蛋白（SHBs）同S基因編碼，由226個(gè)氨基酸組成;中蛋白（MHBs）由S及preS2 基因區(qū)所編碼，由281個(gè)氨基酸組成;大蛋白（LHBs）由S，preS2 及PreS1 基因所編碼，由于PreS1 基因在不同亞型的病毒中存在的形式不同，所以大蛋白（LHBs）由389或400個(gè)氨基酸組成.這3種蛋白都存在糖基化和非糖基化形式［3］ .由于前S區(qū)在參與病毒與宿主細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮著重要功能.目前對前S1 ，前S

29、2 抗原及其相關(guān)受體的研究成為HBV研究的一個(gè)熱點(diǎn)［4-10］ .研究結(jié)果表明:前S1 （21～47aa）可直接與人肝癌HepG2 細(xì)胞特異性結(jié)合，但是此研究僅限于蛋白水平，前S2 則通過多聚白蛋白（pHSA）與肝細(xì)胞包結(jié)合［7，11-13］ .酵母雙雜交系統(tǒng)是一種新的直接在真核細(xì)胞內(nèi)檢測蛋白相互作用的新方法，靈敏度高.酵母雙雜交技術(shù)從1989年由Fields等［14］ 提出并初步建立以來，得到了不斷的完善和改進(jìn).本實(shí)驗(yàn)在酵母雙雜交Ga

30、</p><p><b>　　參考文獻(xiàn): </b></p><p>　?。?］Heermann KH，Goldmann U，Schwartz W，Seyffarth T，Baum-garten H，Gerlich WH.Immunogenicity of the gene and PreS domain in HBV and HBsAg filaments ［J］.I

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