microRNA-182及TGF-β2在骨肉瘤細胞中的表達及其對腫瘤細胞生物學行為調(diào)控作用的研究.pdf

1、目的:本研究首先探索microRNA-182及TGF-β2在骨肉瘤細胞與正常成骨細胞及骨肉瘤組織與其周圍正常組織中的表達是否存在差異;其次，干擾microRNA-182的表達，檢測TGF-β2的表達變化，分析microRNA-182能否引起TGF-β2的表達變化;最后，在干擾microRNA-182表達的前提下，檢測其是否能夠引起骨肉瘤細胞生物學行為的變化。
　　方法:本研究以骨肉瘤MG-63細胞系和正常成骨細胞系hFOB1.19

2、以及骨肉瘤組織及其周圍正常組織作為研究對象。首先，通過實時熒光定量PCR檢測兩種細胞系及組織中microRNA-182的表達情況;免疫熒光技術（除外組織檢測）及westernblot法檢測兩種細胞系及組織中TGF-β2的表達情況。其次，對MG-63細胞進行細胞轉(zhuǎn)染并分別檢測兩種細胞系中microRNA-182及TGF-β2的表達變化，分析兩者之間的可能調(diào)控關系。最后，對MG-63細胞進行細胞轉(zhuǎn)染，通過不同的檢測技術來觀察骨肉瘤細胞的活性

3、、增殖、凋亡、遷移及侵襲的變化。轉(zhuǎn)染前分組為MG-63細胞組與hFOB1.19組及骨肉瘤組織組與正常組織組，所得數(shù)據(jù)采用t檢驗進行統(tǒng)計學分析;對于MG-63細胞轉(zhuǎn)染后分組為inhibitor negative control組、mimicnegative control組、microRNA-182 inhibitor組、microRNA-182 mimic組，所得數(shù)據(jù)采用方差分析及Tukey's Multiple Comparison檢

4、驗方法進行統(tǒng)計學分析。
　　結果:1、提取MG-63細胞與hFOB1.19細胞及骨肉瘤組織與其周圍正常組織中的小RNA，使用qRT-PCR方法檢測microRNA-182的表達水平。結果表明，microRNA-182在MG-63細胞及骨肉瘤組織中的表達量明顯低于其在hFOB1.19細胞及正常組織中的表達量，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05; P＜0.01）。2、使用細胞的平均熒光強度值來評價TGF-β2的表達量，熒光圖像結果顯示，

5、TGF-β2在MG-63細胞中的表達量與hFOB1.19細胞相比呈相對高表達狀態(tài)。使用GAPDH作為內(nèi)參，Western blot法檢測兩種細胞系及組織中TGF-β2的表達情況。實驗結果表明，TGF-β2在MG-63細胞及骨肉瘤組織中的表達量與hFOB1.19細胞及正常組織相比呈相對高表達，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01; P＜0.01）。3、MG-63細胞轉(zhuǎn)染后，提取細胞中的小RNA，使用qRT-PCR的方法檢測不同細胞轉(zhuǎn)染組中mi

6、croRNA-182的表達情況。結果顯示，microRNA-182 inhibitor組(0.63±0.12)與inhibitor negativecontrol組(1.87±0.08)比較其表達量明顯降低;同時microRNA-182 mimic組(2.81±0.15)與mimic negative control組(1.89±0.11)相比其表達量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。4、MG-63細胞轉(zhuǎn)染后，使用細胞的平均

7、熒光強度值來評價TGF-β2的表達量。熒光圖像顯示，microRNA-182 inhibitor轉(zhuǎn)染組中TGF-β2的表達水平高于inhibitor negative control組;microRNA-182 mimic轉(zhuǎn)染組中TGF-β2的表達水平低于mimic negative control組。提取各組MG-63細胞的蛋白樣本，使用GAPDH作為內(nèi)參，western blot法檢測TGF-β2的表達變化。實驗結果顯示，micro

8、RNA-182 inhibitor轉(zhuǎn)染組中TGF-β2的表達量明顯高于inhibitor negative control組;microRNA-182 mimic轉(zhuǎn)染組中TGF-β2的表達量明顯低于mimic negative control組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。5、MG-63細胞轉(zhuǎn)染后，通過我們獲得的OD值及標準曲線繪制了不同時間點的細胞增殖曲線，與細胞活性的變化相同，表達沉默microRNA-182可以促進腫瘤細胞

9、的增殖;過表達microRNA-182可以抑制腫瘤細胞的增殖（P＜0.05; P＜0.01）。6、MG-63細胞轉(zhuǎn)染后，通過流式分析結果可知，inhibitor negative control組、mimic negativecontrol組、microRNA-182 inhibitor組以及mimic組的細胞凋亡比例分別為7.32±0.27％、7.28±0.44％、4.62±0.48％以及14.76±0.72％; microRNA-1

10、82 mimic組的細胞凋亡比例高于對照組;microRNA-182 inhibitor組的細胞凋亡比例低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05;P＜0.01)。7、MG-63細胞轉(zhuǎn)染后，inhibitor negativecontrol組、mimic negative control組、microRNA-182 inhibitor組、mimic組的細胞遷移數(shù)量分別為87±10、91±7、165±9、55±8個（每個視野）;inhib

11、itornegative control組、mimic negative control組、microRNA-182 inhibitor組及mimic組的細胞侵襲數(shù)量分別為71±9、72±10、129±11、36±7個（每個視野）;microRNA-182 inhibitor組的細胞遷移及侵襲數(shù)量明顯升高(P＜0.05; P＜0.01)，因此下調(diào)microRNA-182的表達可以促進MG-63細胞的遷移及侵襲。
　　結論:micr