人PERK和ATF4基因siRNA腺病毒的構(gòu)建及對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的:
　　探討靶向構(gòu)建的攜帶人蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）基因和活化轉(zhuǎn)錄因子4（activiting transcription factor4，ATF4）基因的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）重組腺病毒對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法:
　　應(yīng)用AdEasyTM腺病毒載體系統(tǒng)，

2、構(gòu)建并包裝重組腺病毒siPERK和siATF4。感染細(xì)胞后，通過(guò)RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)軟骨細(xì)胞ATDC5中PERK和ATF4 mRNA和蛋白的表達(dá)。應(yīng)用衣霉素（Tunicamycin，TM）建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）模型，觀察當(dāng)ATF4被沉默時(shí)，ATDC5細(xì)胞的增殖和凋亡情況，以及感染重組腺病毒siPERK時(shí)，SW1353細(xì)胞的增殖和凋亡情況；微團(tuán)培養(yǎng)ATDC5和C3H10

3、T1/2細(xì)胞，應(yīng)用骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone morphogenetic protein2，BMP2）誘導(dǎo)細(xì)胞分化，分別在第1,3,5天時(shí)感染Ad-RFP、siPERK和siATF4重組腺病毒，采用FCM、TUNEL、免疫印跡和免疫組化等檢測(cè)軟骨細(xì)胞分化過(guò)程中的凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　成功構(gòu)建并獲得重組腺病毒siPERK和siATF4。重組腺病毒處理細(xì)胞48h后，ATDC5細(xì)胞中PERK和ATF4的mRNA和蛋白表達(dá)水平

4、明顯下降（P<0.05）。在ERS狀態(tài)下，siATF4感染后，與對(duì)照組相比較，ATDC5細(xì)胞的凋亡率明顯降低（P<0.05），增殖明顯增加（P<0.05）；siPERK重組腺病毒感染細(xì)胞后，SW1353細(xì)胞增殖增加（P<0.05），凋亡率降低（P<0.05）；在BMP2誘導(dǎo)細(xì)胞分化過(guò)程中，F(xiàn)CM結(jié)果顯示，siPERK和siATF4重組腺病毒聯(lián)合感染組細(xì)胞凋亡率逐漸升高，且高于對(duì)照組（P<0.05）。免疫印跡和免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與FCM結(jié)果