鯉魚IRF基因克隆及其免疫功能的初步研究.pdf

1、干擾素調(diào)節(jié)因子(IRFs)是一類轉(zhuǎn)錄因子家族,參與干擾素(IFN)和干擾素刺激基因(ISGs)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),而且IRF家族成員在病原體應(yīng)答、細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)和造血細(xì)胞分化中都有重要作用。目前在哺乳類中已鑒定了9個IRF家族成員,分別為 IRF-1、IRF-2、IRF-3、IRF-4/PIP/LSIRF/ICSAT、IRF-5、IRF-6、IRF-7、IRF-8/ICSBP和IRF-9/ISGF3γ/p48,而在魚類中鑒定了1

2、1個 IRF家族成員,比哺乳類多了IRF-10和IRF-11。IRF家族成員在N端都有一個同源的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD),由115個氨基酸形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的結(jié)構(gòu),含有特征性的5個色氨酸重復(fù)。除了IRF-1和IRF-2,其它IRF還含有一個IRF相關(guān)結(jié)構(gòu)域(IAD),介導(dǎo)IRF蛋白3’末端的相互作用。IRF家族這11個成員可根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的相似性分成4個亞家族,分別為IRF-1亞家族、IRF-3亞家族、IRF-4亞家族和IRF-5亞

3、家族。
　　對哺乳類IRF家族成員的研究發(fā)現(xiàn)IRF-1、IRF-3、IRF-5和IRF-7參與Ⅰ型IFN基因的正反饋調(diào)節(jié),從而在抗病毒天然免疫中發(fā)揮重要作用。近來,魚類中被發(fā)現(xiàn)存在與哺乳類相似的IFN系統(tǒng),由于IRF家族在IFN系統(tǒng)中的重要作用,對魚類IRF家族成員的研究也逐漸增加。鯉魚是我國重要的養(yǎng)殖魚類,很容易受到病毒的感染,研究其抗病毒機(jī)制有重要意義。目前IRF-3和IRF-7已在鯉魚中得到鑒定,因此本研究用RACE技術(shù)克隆

4、得到了鯉魚IRF-1和IRF-5基因的cDNA全長,并通過Real-time PCR分析這兩個蛋白的組織表達(dá)和poly I:C刺激表達(dá),從而對它們的免疫功能進(jìn)行了初步研究。
　　本研究克隆得到的鯉魚IRF-1基因的cDNA全長為1427nt,5’非編碼區(qū)長126 nt,3’非編碼區(qū)長440nt,861 nt的開放閱讀框(ORF)編碼286 aa的蛋白。鯉魚IRF-1蛋白N端有含6個色氨酸重復(fù)的DBD結(jié)構(gòu)域。鯉魚IRF-5基因的cD

5、NA全長2042 nt,5’非編碼區(qū)長266nt,3’非編碼區(qū)長222nt,1554nt的ORF編碼517aa的蛋白。鯉魚IRF-5蛋白N端有含5個色氨酸重復(fù)的DBD,C端含有IAD。鯉魚IRF-1與其它IRF-1蛋白全長的一致度在43.7％-78.4%,DBD的一致度在71.9%-93.0%,而C端的一致度僅為13.8%-69.5%。鯉魚IRF-1與斑馬魚IRF-1的全長有最高一致度,與草魚IRF-1的DBD最接近。鯉魚IRF-5與其

6、它IRF-5蛋白全長的一致度在50.3%-90.0%,而DBD的一致度在58.8%-96.5%,IAD的一致度為63.0%-97.3%。鯉魚IRF-5與草魚IRF-5有最高的相似性,全長和各結(jié)構(gòu)域的一致度最高。進(jìn)化分析顯示鯉魚IRF-1和IRF-5分別屬于IRF-1亞家族和IRF-5亞家族,它們與對應(yīng)的哺乳類和其它魚類IRF同源物親緣關(guān)系相近。以上分析顯示鯉魚IRF-1和IRF-5在進(jìn)化上較保守。
　　Real-time PCR分

7、析顯示鯉魚IRF-1和IRF-5基因在所有檢測器官中都表達(dá),但不同組織表達(dá)量有差異。IRF-1在脾中表達(dá)量最高,而IRF-5在鰓中有最高表達(dá),并且IRF-1的表達(dá)量整體高于IRF-5的表達(dá)量。為研究鯉魚IRF-1和IRF-5在抗病毒免疫應(yīng)答中的作用,本實(shí)驗(yàn)對鯉魚腹腔注射poly I:C,然后檢測注射后各時間段各免疫相關(guān)器官中兩個基因的表達(dá)水平變化。研究發(fā)現(xiàn),注射poly I:C后IRF-1基因在頭腎、肝、脾、鰓、前腸、后腸和皮膚中的表達(dá)

8、模式相似,都是在刺激后表達(dá)迅速上調(diào),達(dá)到最高值后表達(dá)逐漸下降,最后恢復(fù)到正常表達(dá)水平。IRF-1在前腸中的誘導(dǎo)表達(dá)最快最高,在刺激后3 h就上調(diào)到22.1倍。而刺激后IRF-5基因在頭腎、肝、后腸和皮膚中的表達(dá)變化量相對較小,在前腸、脾和鰓中的變化量比較大,IRF-5的表達(dá)有較大幅度的升高,分別上調(diào)到22.8倍、4.1倍和4.2倍。這些研究說明鯉魚 IRF-1和IRF-5可能在抗病毒天然免疫中發(fā)揮重要作用,并且IRF-5對IFN的誘導(dǎo)表