Hsf4在晶狀體上皮細(xì)胞中的抗凋亡分子機(jī)制.pdf

1、背景：熱休克反應(yīng)（HSR）是生物機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下所表現(xiàn)的，以熱休克蛋白誘導(dǎo)表達(dá)為特征的自我保護(hù)反應(yīng)。熱休克蛋白應(yīng)用其分子伴侶活性對(duì)修飾應(yīng)激而致的變性蛋白結(jié)構(gòu)的正確折疊或引領(lǐng)變性蛋白在溶酶體，Ubquitin-proteasome降解，從而穩(wěn)定細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。熱休克反應(yīng)主要受熱休克轉(zhuǎn)錄因子（HSF）調(diào)控。熱休克轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基因啟動(dòng)子的熱休克元件調(diào)節(jié)表達(dá)熱休克蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。哺乳類動(dòng)物表達(dá)4個(gè) HSF家族成員。Hsf4是這個(gè)家族成員之一，

2、是晶狀體中執(zhí)行熱休克反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子。有研究發(fā)現(xiàn)， Hsf4功能異常導(dǎo)致晶狀體分化異常和白內(nèi)障的發(fā)生。
　　白內(nèi)障分為先天性白內(nèi)障和老年性白內(nèi)障。先天性白內(nèi)障是胚胎時(shí)期晶狀體發(fā)育異常所致，其發(fā)育過程伴隨很多的凋亡發(fā)生；老年性白內(nèi)障為白內(nèi)障主要類型，占白內(nèi)障病人的80％，75歲以上的老年人患病率為70%，其病因是晶狀體受到外界的高溫，缺氧，紫外照射等不良環(huán)境的影響，促使晶狀體蛋白變性甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡引起的。Hsf4是調(diào)控晶狀體發(fā)育

3、的關(guān)鍵因子， Hsf4a和 Hsf4b是其兩種亞型，其中 Hsf4b是調(diào)節(jié)晶狀體發(fā)育的唯一亞型。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)，Hsf4參與調(diào)控αB-crystallin和 Hsp25等小分子伴侶的表達(dá)。Roxana Chis發(fā)現(xiàn)，小鼠心肌細(xì)胞受到 H2O2刺激后，αB-crystallin能從細(xì)胞胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，并且與 VDAC, TOM20，caspase3和caspase12相互作用，從而抵抗H2O2刺激導(dǎo)致的細(xì)

4、胞凋亡。其它研究也證明了αB-crystallin在心肌細(xì)胞與小鼠子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中，與線粒體凋亡通路直接作用，抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊壓力，過氧化和炎癥等各種細(xì)胞壓力導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。因此，推論 Hsf4b通過上調(diào)αB-crystallin蛋白表達(dá)，抑制外界誘導(dǎo)的晶狀體細(xì)胞凋亡。本課題利用敲除和過表達(dá)Hsf4b的晶狀體上皮細(xì)胞，進(jìn)一步探討Hsf4b在晶狀體上皮細(xì)胞中的抗凋亡的分子機(jī)制。
　　目的：研究晶狀體上皮細(xì)胞中， Hsf4及其下游蛋白

5、αB-crystallin抵抗細(xì)胞凋亡具體的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.用caspase-3檢測(cè)試劑盒檢測(cè)caspase-3的活性，用免疫印跡檢測(cè)cleaved caspase-3和hsf4b下游相關(guān)基因的蛋白水平和ERK和p-ERK的蛋白水平，。
　　2.利用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)線粒體膜電位。
　　3.利用線粒體分離實(shí)驗(yàn)，免疫印跡檢測(cè)線粒體蛋白和胞質(zhì)蛋白中細(xì)胞色素 C和Hsf4b下游蛋白αB-crys

6、tallin的蛋白量。
　　4.用免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞色素C、Bax、αB-crystallin和線粒體的共定位。
　　5.用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　6. pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了αB-crystallin與細(xì)胞色素C和促凋亡因子Bax存在相互作用。
　　7.用活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平。
　　結(jié)果：在晶狀體上皮細(xì)胞中，Hsf4b具有穩(wěn)定線粒體膜勢(shì)（ΔΨ），抑制順鉑，雙氧水刺激誘導(dǎo)的細(xì)