外傷性白內(nèi)障后皮質(zhì)混濁對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、外傷性白內(nèi)障是正常的晶狀體受傷后，晶狀體囊和皮質(zhì)遭受破壞，致房水進(jìn)入晶狀體內(nèi)引起上皮水腫；也可因組織損傷，晶狀體纖維變性或者形成瘢痕發(fā)生混濁。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)告，在眼球穿通傷中外傷障的發(fā)生率為36％-52％，占視力致殘率的28％。外傷障行白內(nèi)障摘除術(shù)后，由于接觸抑制的解除、殘留皮質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)作用以及血-房水屏障的破壞，將促使晶狀體上皮細(xì)胞的增生和移行，導(dǎo)致后囊的混濁。 在外傷性白內(nèi)障的形成過(guò)程中，晶狀體上皮細(xì)胞間連接的破壞以及細(xì)胞正常代謝

2、的紊亂、壞死和凋亡將會(huì)造成晶狀體纖維的變性、變形，最終導(dǎo)致晶體皮質(zhì)混濁。而晶狀體纖維的變性、變形也會(huì)進(jìn)一步影響正常晶狀體上皮細(xì)胞的代謝，加重上皮細(xì)胞的損傷，同時(shí)由于接觸抑制并未解除，晶狀體上皮細(xì)胞無(wú)處增生，而生存環(huán)境又較正常環(huán)境惡化，理論上應(yīng)該引起上皮細(xì)胞的凋亡和溶解。晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的數(shù)量越多，剩余晶狀體上皮細(xì)胞的數(shù)量越少，行白內(nèi)障摘除術(shù)后，晶狀體上皮細(xì)胞的增生也將會(huì)減少。 目前尚未見(jiàn)這方面的報(bào)道，因此，我們建立了外傷性白內(nèi)

3、障模型，來(lái)探索皮質(zhì)混濁與晶體上皮細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，以指導(dǎo)在合適時(shí)機(jī)施行白內(nèi)障術(shù)，使大多數(shù)的上皮細(xì)胞凋亡，從而降低后發(fā)障的發(fā)生率。 材料與方法 1 體外牛眼外傷性白內(nèi)障模型的建立和分組將取回的牛眼完整分離出晶狀體后，分為前囊組(10 只)、后囊組(10 只)、赤道組(10 只)和對(duì)照組(10 只)。前囊組，在晶狀體前囊上，用一次性無(wú)菌針頭垂直刺破3～4個(gè)直徑約1～2mm的傷口，并旋轉(zhuǎn)針頭，攪動(dòng)前囊膜下皮質(zhì)后，將其放入盛有

4、與房水PH值相同的DMEM液的密閉無(wú)菌的玻璃器皿中。后囊組和赤道組與前囊組模型建立的方法大致相同，不同的是，用無(wú)菌針頭分別在后囊膜和赤道部囊膜處刺破，并攪動(dòng)刺破處囊膜下皮質(zhì)，使其混濁，形成不同部位的白內(nèi)障模型；對(duì)照組用完整的晶狀體作培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后的1d、3d、6d、9d和12d取出四組晶狀體觀察并取前囊膜和赤道部囊膜鋪片，進(jìn)行Giemsa染色，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。行TUNEL染色，計(jì)算每個(gè)標(biāo)本在400倍視野下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的全部細(xì)胞數(shù)

5、和凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞所占百分比即為上皮細(xì)胞凋亡率。 2 兔眼外傷性白內(nèi)障模型的建立及分組選擇體重在2～2.5kg的健康新西蘭白兔25只，雌雄不限，所有家兔隨機(jī)分為5組。實(shí)驗(yàn)眼在手術(shù)顯微鏡下用一次性1mm注射器針頭，在角膜偏中央位置刺穿角膜，用針頭在晶狀體前囊上劃開(kāi)1×1.5mm大小的切口，并刺入切口囊膜下攪動(dòng)皮質(zhì)，使其混濁，建立外傷性白內(nèi)障模型。分別為傷后12h、1d、3d、5d和9d五個(gè)時(shí)項(xiàng)組，隨機(jī)選擇一組家兔經(jīng)耳緣靜脈用空氣針

6、處死，一只眼作為實(shí)驗(yàn)眼，另一只眼作為對(duì)照眼。術(shù)后每天行裂隙燈顯微鏡觀察術(shù)眼晶狀體混濁情況。于傷后12h、1d、2d、3d、5d和9d取各組前囊和赤道部囊膜行Giemsa染色和TUNEL染色，計(jì)算每個(gè)標(biāo)本在400倍視野下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的全部細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞所占百分比即為上皮細(xì)胞凋亡率。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1 體外培養(yǎng)不同時(shí)間后牛眼晶狀體混濁情況的觀察損傷后12h出現(xiàn)局限性云霧狀混濁；損傷后第3d，損傷部位的晶狀體混濁

7、范圍擴(kuò)大，顏色變白；損傷后第6d，所有被損傷的晶狀體呈完全性混濁，混濁程度加深；損傷后第9d，被損傷的晶狀體呈明顯的乳白色混濁。對(duì)照組晶體透明，未見(jiàn)混濁出現(xiàn)。 2 裂隙燈顯微鏡觀察兔眼外傷性白內(nèi)障模型的建立情況損傷后實(shí)驗(yàn)眼立即出現(xiàn)局限性云霧狀混濁；損傷后24h內(nèi)所有實(shí)驗(yàn)眼存在較明顯的反應(yīng)性炎癥，實(shí)驗(yàn)眼的晶狀體混濁范圍明顯擴(kuò)大，呈淡白色云霧狀；損傷后的第4d前房?jī)?nèi)絮狀物基本消失，所有實(shí)驗(yàn)眼出現(xiàn)出現(xiàn)不同程度的晶狀體混濁，其中2只為局

8、限性混濁，其余為完全性混濁，混濁度加深，均為白色絮狀混濁：損傷后第7d，發(fā)展為較為明顯的白內(nèi)障混濁，呈白色乳塊狀完全性混濁，此后晶狀體呈漸進(jìn)性混濁。對(duì)照眼，晶狀體透明，始終未見(jiàn)晶狀體混濁。 3 Giemsa染色觀察牛眼和兔眼晶狀體上皮細(xì)胞的形態(tài)隨著晶體皮質(zhì)混濁時(shí)間的延長(zhǎng)，牛眼和兔眼晶狀體上皮細(xì)胞都表現(xiàn)為前囊下上皮細(xì)胞的減少，細(xì)胞變小，細(xì)胞間隙增寬，邊界不清，核固縮的逐漸增多。 4 TUNEL染色并檢測(cè)牛眼和兔眼晶狀體上皮細(xì)胞的凋

9、亡率TUNEL染色后，牛眼和兔眼晶狀體上皮細(xì)胞隨著晶體混濁的發(fā)展，棕色的調(diào)亡細(xì)胞核逐漸增多，而對(duì)照組則無(wú)明顯變化。 5 牛眼和兔眼晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡率牛眼前囊組晶狀體上皮細(xì)胞在模型建立后3d、6d、9d、12d和20d的凋亡率分別為10.02±1.056、19.34±2.15、29.52±0.31、38.054±3.41和47.815±0.31。對(duì)前囊組晶狀體上皮細(xì)胞不同時(shí)間的凋亡率進(jìn)行直線相關(guān)性分析，r=0.91，說(shuō)明前囊組

10、晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡率隨時(shí)間的變化，呈顯著正相關(guān)關(guān)系。后囊組凋亡率分別為3.54±0.11、3.97±1.02、8.33±0.35、19.81±2.47和35.41±0.77。進(jìn)行直線相關(guān)性分析，r=0.63，呈正相關(guān)關(guān)系。赤道組凋亡率分別為6.82±1.05、11.74±0.21、18.57±1.73、27.38±1.41和41.55±2.73。進(jìn)行直線相關(guān)性分析，r=0.87，呈正相關(guān)關(guān)系。分別在不同時(shí)間將牛眼晶狀體上皮細(xì)胞4組的凋

11、亡率進(jìn)行單因素的方差分析，第3d時(shí)： F=6.36，P<0.05，說(shuō)明4組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第6d時(shí)： F=7.21，P<0.05，說(shuō)明4組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第9d時(shí)： F=9.32，P<0.05，說(shuō)明4組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第12d時(shí)：F=5.21，P<0.05，說(shuō)明4組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第20d時(shí)：F=7.24，P<0.05。說(shuō)明4組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 兔眼晶狀體上皮細(xì)胞在模型建立后12h、ld、3d、5d

12、和9d的調(diào)亡率分別為2.17±0.21、2.347±0.35、7.13±1.31、12.33±0.19和17.286±0.72。對(duì)實(shí)驗(yàn)組晶狀體上皮細(xì)胞不同時(shí)間的凋亡率進(jìn)行直線相關(guān)性分析，r=0.75，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡率隨時(shí)間的變化，呈正相關(guān)關(guān)系。分別在不同時(shí)間將兩組兔眼的凋亡率進(jìn)行配對(duì)資料的t檢驗(yàn)，ld時(shí)t=2.32，P<0.05；2d時(shí)t=2.48.P<0.05；3d時(shí)t=2.82，P<0.05，說(shuō)明2組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)