Derlin-1在RLE-6TN細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)性凋亡中的作用研究.pdf

1、目的：探索抑制Derlin-1表達(dá)是否增加香煙煙霧（CSE）誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞凋亡，以及其作用機(jī)理是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）機(jī)制相關(guān)，從而初步探討Derlin-1在香煙煙霧誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)性凋亡中作用。
　　方法：RLE-6TN細(xì)胞培養(yǎng)；用攜帶Derlin-1干擾序列的siRNA侵染RLE-6TN細(xì)胞沉默Derlin-1基因，用加入等量空白質(zhì)粒組作為對(duì)照；制備CSE；用10％CSE處理對(duì)照組、沉默組RL

2、E-6TN細(xì)胞0h、3h、6h、12h、24h后：流式細(xì)胞儀檢測(cè)干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率；免疫熒光技術(shù)、Western blot、Realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)干預(yù)前后Derlin-1、P-IRE1、Hrd1、P-JNK、CHOP蛋白及mRNA的表達(dá)；
　　結(jié)果:1.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:RLE-6TN細(xì)胞在10%CSE處理0h、3h、6h、12h、24h后，大鼠肺II型上皮細(xì)胞在對(duì)照組早期凋亡率分別為：5.8%、7.1%、12.

3、2%、14.5%、22.1%，沉默組早期凋亡率分別為為15.4%、15.7%、33%、43.3%、48.9%，對(duì)照組與沉默組細(xì)胞隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢(shì)，沉默組細(xì)胞凋亡在早期和晚期都明顯高于對(duì)照組，差異具有顯著性（P<0.05）。
　　2.免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Derlin-1蛋白質(zhì)熒光表達(dá)顯示：自然生長(zhǎng)的RLE-6TN細(xì)胞經(jīng)CSE處理后，Derlin-1蛋白質(zhì)表達(dá)水平(0.117±0.011)高于對(duì)照組（0.095±0.005）

4、，差異具有顯著性（P<0.05）；Derlin-1沉默組RLE-6TN細(xì)胞經(jīng)CSE處理后，Derlin-1蛋白表達(dá)水平（0.064±0.003)高于對(duì)照組（0.014±0.001），差異具有顯著性（P<0.05）。Derlin-1干擾前后CSE處理組Derlin-1蛋白表達(dá)水平均增加。
　　3.Western blot檢測(cè)Derlin-1蛋白表達(dá)顯示：對(duì)照組RLE-6TN細(xì)胞在CSE處理0h、3h、6h、12h、24h后Derli

5、n-1表達(dá)分別為（1.76±0.19、1.97±0.223.75±0.23、4.85±0.70、1.01±0.11），Derlin-1蛋白在12h表達(dá)高峰，24h組表達(dá)開始降低，不同時(shí)間組之間比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P均<0.05)。沉默組Derlin-1蛋白表達(dá)分別為（0.18±0.05、0.34±0.08、0.49±0.07、0.66±0.09、0.89±0.12），Derlin-1在CSE作用早期0h、3h、6h表達(dá)無明顯變化，差

6、異無統(tǒng)計(jì)意義（P>0.05)，12h、24h晚期組表達(dá)明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)；與對(duì)照組比沉默組Derlin-1蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)；RT-PCR結(jié)果顯示Derlin-1 mRNA檢測(cè)結(jié)果與Westen blot結(jié)果一致。
　　4.Western blot檢測(cè)ERS通路相關(guān)因子結(jié)果顯示：對(duì)照組總IRE1，P-IRE1、Hrd1、總JNK、P-JNK、CHOP蛋白在CSE作用0h、3h、6

7、h、12h、24h組的表達(dá)別為（15.08±2、17.42±1.44、15.38±2.02、17.24±1.24、14.18±1.14；0.95±0.01、1.62±0.02、2.26±0.03、7.13±0.31、9.12±0.20；0.21±0.01、0.69±0.08、1.21±0.23、1.70±0.34、2.18±0.40；0.97±0.07、0.94±0.11、1.11±0.06、
　　1.05±0.04、1.12±0

8、.09；0.29±0.02、0.66±0.02、0.63±0.01、0.60±0.11、0.71±0.15；1.32±0.40、2.92±0.50、4.53±0.60、10.54±1.04、9.01±1.4），在總IRE、總JNK的表達(dá)不同時(shí)間點(diǎn)均無明顯差異（P<0.05)，P-IRE1、Hrd1、P-JNK、CHOP著CSE作用時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)，不同時(shí)間時(shí)間點(diǎn)組之間兩兩比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P均<0.05)。沉默組總IRE1、P-

9、IRE1、Hrd1、總JNK、P-JNK、CHOP蛋白表達(dá)隨CSE作用不同時(shí)間分別為（1.67±0.14、1.62±0.21、1.74±0.45、1.78±0.39、1.69±0.25；0.33±0.02、0.48±0.02、0.84±0.04、0.36±0.01、0.32±0.03；0.32±0.01、0.38±0.03、0.42±0.04、0.48±0.05、0.56±0.07；0.87±0.24、0.65±0.031、0.85±0

10、.15、0.82±0.033、0.872±0.19；0.22±0.01、0.46±0.07、0.64±0.08、0.24±0.03、0.28±0.04；0.41±0.06、0.80±0.08、1.70±0.19、1.99±0.21、1.60±0.19），在總IRE1、JNK蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯變化，各時(shí)間點(diǎn)組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)無明顯差異（P>0.05)；沉默Derlin-1基因后P-IRE1、P-JNK、CHOP早期表達(dá)升高，晚期逐漸下降

11、，P-IRE1、P-JNK在3h、6h組與其他組之間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，而在0h、12h、24h組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。Hrd1在CSE作用早期0h、3h、6h表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)意義（P>0.05)，12h、24h晚期組表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，沉默組在3h,6h組較對(duì)照組明顯降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。CHOP在3h、6h、12h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)同其他各時(shí)間點(diǎn)組之

12、間之間兩兩比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在0h、24h時(shí)間組無明顯變化（P>0.05)。
　　5.RT-PCR結(jié)果顯示：Derlin-1沉默組IRE1、Hrd1、JNK、CHOP mRNA隨時(shí)間表達(dá)變化同Westen blot結(jié)果基本一致。
　　結(jié)論：CSE能夠誘導(dǎo)AECII發(fā)生ERS并進(jìn)一步介導(dǎo)ERAD，Derlin-1基因沉默下調(diào)ERAD作用，致使CSE誘導(dǎo)的II型肺泡上皮細(xì)胞凋亡增加，研究結(jié)果提示Derlin-