CaMKⅡ在鎘致原代大鼠成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑中的作用.pdf

1、鎘作為廣泛存在的重金屬污染物，通常以鎘離子的形式通過鈣離子泵、離子通道型受體等進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而影響胞內(nèi)鈣離子分布。胞內(nèi)鈣離子濃度改變引起CaMKⅡ表達(dá)水平的變化以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。而CaMKⅡ在成骨細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用鮮有報(bào)道。為了研究鎘致鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生的影響，原代成骨細(xì)胞暴露于鎘及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子通道抑制劑2-APB，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，RTCA檢測細(xì)胞存活率，蛋白免疫印跡法檢測UPR相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表

2、明2μmol/L醋酸鎘、50μmol/L2-APB及其共處理成骨細(xì)胞后，與對照組相比，鎘處理導(dǎo)致細(xì)胞存活率顯著降低，且伴隨著細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高（P＜0.01）;2-APB與鎘共處理組和鎘處理組相比，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著降低（P＜0.01）;不同濃度的醋酸鎘（0、0.25、0.5、1、2、5、10μmol/L）處理6h或2μmol/L醋酸鎘處理成骨細(xì)胞不同時(shí)間（0、0.5、1、5、10、30 min或2、4、6h）后，與對照組相比，2μ

3、mol/L醋酸鎘處理成骨細(xì)胞6小時(shí)能顯著提高BiP、ATF4、CHOP三個(gè)蛋白的表達(dá)水平（P＜0.05或P＜0.01）。為了研究鎘對成骨細(xì)胞CaMKⅡ表達(dá)的影響及CaMKⅡ在鎘致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用，原代成骨細(xì)胞暴露于鎘、2-APB或CaMKⅡ抑制劑KN93，RTCA檢測細(xì)胞存活率，蛋白免疫印跡法檢測CaMKⅡ、P-CaMKⅡ和UPR相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明與對照組相比，2μmol/L醋酸鎘處理成骨細(xì)胞6小時(shí)能顯著提高CaMKⅡ的磷酸化水

4、平;與鎘處理組相比，2-APB與鎘共處理組顯著降低CaMKⅡ的磷酸化水平;而KN93與鎘共處理組顯著提高細(xì)胞存活率，且顯著降低了ATF4和CHOP蛋白的表達(dá)(P＜0.05或P＜0.01)。為了研究鎘致成骨細(xì)胞凋亡的過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和CaMKⅡ的作用，成骨細(xì)胞暴露于鎘、2-APB或KN93，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，雙苯酰亞胺(Hoechst33258)染色觀察細(xì)胞核形態(tài)，蛋白免疫印跡法檢測Caspase-12、3，Bax和Bcl-2蛋白

5、的表達(dá)。結(jié)果表明2μmol/L鎘暴露成骨細(xì)胞6h后，細(xì)胞凋亡率、Caspase-12、3蛋白活化水平和Bax/Bcl-2水平極顯著高于對照組（P＜0.01）;2-APB與鎘共處理組以及KN93與鎘共處理組細(xì)胞凋亡率、Caspase-12、3蛋白活化水平和Bax/Bcl-2水平極顯著低于鎘處理組(P＜0.01); Hoechst33258染色結(jié)果與上述一致。綜上所述，鎘通過引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子造成胞漿鈣超載，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，最后通過C