鮑氏層孔菌菌絲體多糖分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性的研究.pdf

1、鮑氏層孔菌(Phellinus baumii Pilát)為擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)、針層孔菌屬(Phellinus)的珍稀藥用真菌。其子實體俗稱桑黃,為我國傳統(tǒng)中藥材。近年來的研究表明,其子實體提取物具有抗腫瘤、免疫刺激、抗突變、降血糖、抗氧化和清除自由基等活性。到目前為止,人們對鮑氏層孔菌的研究大多數(shù)集中在子實體的粗多糖的研究,而對液體培養(yǎng)的鮑氏層孔菌菌絲體多糖(P

2、BMP)的分離純化、理化性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)特征進行深入研究的報道甚少。
　　 傳統(tǒng)上,鮑氏層孔菌的活性成分多糖通常從子實體中提?。坏捎邗U氏層孔菌野生資源(子實體)的日益匱乏,加之人工栽培周期長、難度較大,這已限制了對該菌的進一步開發(fā)和利用。而液體深層發(fā)酵具有周期短、菌絲體多糖產(chǎn)量高、條件控制容易、污染少、便于發(fā)酵下游加工處理以及工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等特點,是大量獲取菌絲體多糖的理想途徑,因此,采用液體深層發(fā)酵方法是目前開發(fā)鮑氏層孔菌活性

3、成分的一條有效途徑。為了系統(tǒng)的研究鮑氏層孔菌菌絲體多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性,本研究對鮑氏層孔菌進行了液體深層發(fā)酵培養(yǎng),并對其菌絲體多糖進行了提取、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和藥理活性進行研究。
　　 本論文共有四個部分,分別從菌絲體的深層發(fā)酵條件優(yōu)化、多糖分離純化、理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)鑒定、體外清除自由基、體內(nèi)對半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠氧化應(yīng)激的影響以及免疫調(diào)節(jié)和體外抑瘤活性進行了研究。主要結(jié)果如下:
　　 1.液體培養(yǎng)的鮑氏層孔菌多糖發(fā)

4、酵條件的優(yōu)化運用2(7-3)部分因子設(shè)計(FFD)篩選出影響鮑氏層孔菌菌絲體多糖產(chǎn)量的關(guān)鍵因素:葡萄糖、蛋白胨、酵母膏及硫酸鎂；采用響應(yīng)曲面設(shè)計中的中心組合設(shè)計(CCD)對有顯著影響菌絲體多糖產(chǎn)量的關(guān)鍵因素水平進行優(yōu)化,確定培養(yǎng)基的組成分別為(g/l):葡萄糖35.36,酵母膏2.88,蛋白胨2.73,MgSO41.47,KH2PO41,VB10.0075,草酸銨0.3.
　　 在優(yōu)化的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,運用中心組合設(shè)計對鮑氏層孔菌

5、液體發(fā)酵的溫度和pH進行優(yōu)化,篩選出了鮑氏層孔菌液體發(fā)酵的溫度和pH的條件為分別為28℃、6.0。在培養(yǎng)基成分、溫度和pH優(yōu)化基礎(chǔ)上,對P.baumii Pilát分批發(fā)酵過程中的相關(guān)指標(biāo)(菌絲體多糖產(chǎn)量、菌絲體生物量、殘?zhí)?、pH值)的動態(tài)變化規(guī)律進行研究。結(jié)果表明,在發(fā)酵進行144 h時菌球生長良好,菌絲體干重、菌絲體多糖產(chǎn)量達到最大值,分別為13.69 g/l、0.94 g/l。由此可見,利用數(shù)理統(tǒng)計方法對鮑氏層孔菌菌絲體多糖產(chǎn)量的

6、發(fā)酵條件優(yōu)化是經(jīng)濟可行,科學(xué)合理。
　　 2.鮑氏層孔菌菌絲體多糖提取、分離純化、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析液體發(fā)酵得到的菌絲體經(jīng)干燥、粉碎、水提、75％乙醇沉淀、離心,然后用無水乙醇、丙酮以及乙醚洗滌、干燥,即得到鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖。多糖的提取率為6.72％。
　　 運用DEAE-纖維素-52陰離子交換柱層析法對鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖進行初步分離,初步得到三個純化組分F1、F2和F3；再利用葡聚糖G-100凝膠過濾柱層析法

7、對初步純化組分F1、F2和F3進行進一步純化,得到鮑氏層孔菌菌絲體多糖純化組分PBMP—1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3四個組分,其得率分別為32.57％、4.13％、5.08％和0.79％。
　　 采用苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍法和硫酸-間羥聯(lián)苯法測定了PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3四個多糖組分的總糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸含量,其總糖含量分別為99.49％、77.02％、92.03％和71.

8、19％；蛋白質(zhì)含量分別為未檢出、4.99％、1.54％和4.45％,糖醛酸含量分別為2.01％、3.74％、4.29％和5.27％。
　　 采用高效液相凝膠滲透色譜法(HPGPC)對PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3的相對分子量進行測定,并對其純度進行進一步鑒定。結(jié)果表明PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3四個組分都是均一的多糖組分,且其分子量分別為2.95×103 kDa、1.17

9、×103 kDa、16.29 kDa和1.54×103 kDa。
　　 通過糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜法測定了4個多糖組分的單糖組成:PBMP-1由3種單糖組成,其摩爾比為:巖藻糖:葡萄糖:半乳糖=1.00:24.54:0.29:PBMP-2a由4種單糖組成,其摩爾比為:巖藻糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=0.56:0.76:3.23:1.00；PBMP-2b由4種單糖組成,其摩爾比為:巖藻糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=0.23:1.

10、29:1.00:1.01:PBMP-3由5種單糖組成,其摩爾比為:鼠李糖:巖藻糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=0.52:0.58:2.51:1.44:1.00。
　　 FTIR技術(shù)研究表明:PBMP-1、PBMP-2a和PBMP-2b三個組分的糖環(huán)形式均為吡喃糖環(huán)；PBMP-1的糖苷鍵構(gòu)型均為α型,PBMP-2a和PBMP-21b的糖苷鍵構(gòu)型既有α型又有β型。UV掃描表明:PBMP-2a和PBMP-2b中具有少量蛋白質(zhì),而PBMP-

11、1中不合蛋白質(zhì)。
　　 高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反應(yīng)、GC/MS以及NMR技術(shù)研究表明:PBMP-1多糖組分的基本結(jié)構(gòu):α型糖苷鍵構(gòu)型連接,以1,4-葡萄糖殘基和1,6-半乳糖殘基構(gòu)成主鏈,同時以巖藻糖為非還原末端、含有1,3,4-葡萄糖分支和1,4,6-葡萄糖分支等高度分支的不均一多糖；PBMP-2a含有α和β型糖苷鍵,并以α型糖苷鍵為主要連接類型,是以1,4-葡萄糖殘基和1,6-半乳糖殘基構(gòu)成主鏈,以少量的巖藻糖、

12、葡萄糖和甘露糖為非還原末端,并帶有1,6-葡萄糖分支、1,3,4-葡萄糖分支、1,4,6-葡萄糖分支、1,2-甘露糖分支、1,2,6-甘露糖分支的復(fù)合多糖；PBMP-2b含有α和β型糖苷鍵,并以α型糖苷鍵為主要連接類型的復(fù)合多糖,是以1,2,6-甘露糖殘基和1,3,4-葡萄糖殘基構(gòu)成多分支的主鏈,并在甘露糖C6位、葡萄糖C3位上面連接巖藻糖或甘露糖或葡萄糖與1,6-半乳糖構(gòu)成的側(cè)鏈。
　　 3.鮑氏層孔菌菌絲體多糖清除自由基作用

13、及其對半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠氧化應(yīng)激影響采用化學(xué)方法分別研究了鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖PBMP及其純化組分PBMP-1的體外清除O2·自由基、OH·羥基自由基以及抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)活性。結(jié)果表明,鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖PBMP及其純化組分PBMP-1能夠清除超氧陰離子自由基O2·、羥基自由基OH·,并抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)生,而且粗多糖較純化的多糖組分具有較強的活性。
　　 運用D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老動物模型,考察了鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖

14、PBMP及其純化組分PBMP-1對半乳糖引起的小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射D-半乳糖可引起機體氧化損傷,顯著增加肝臟和血清中MDA含量,明顯降低肝臟和血清中抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性以及非酶抗氧化能力TAOC水平。而應(yīng)用鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖PBMP及其純化組分PBMP—1處理,可減弱D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng),顯著提高肝臟和血清中SOD活性、CAT活性、GSH—Px活性以及TAOC水平,顯著降低肝臟和血清

15、中MDA含量,且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。同時,不同劑量的鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖PBMP組、純化組分PBMP-1組能明顯提高衰老小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù),這可能與其提高機體抗氧化活性,減輕自由基對生物膜的損害,從而保護機體及免疫器官免受自由基攻擊有關(guān)。
　　 4.鮑氏層孔菌菌絲體多糖的免疫調(diào)節(jié)與體外抑瘤活性研究采用體外脾細胞模型研究分析了鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖及其純化組分PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3的免

16、疫活性。結(jié)果顯示鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖PBMP及其純化組分PBMP-1、PBMP-2a和PBMP-2b對不加有絲分裂原刺激的脾細胞具有促進增殖作用；同時對ConA誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細胞增殖與LPS刺激的B淋巴細胞增殖均有一定協(xié)同作用,且刺激程度存在一定的差異。而純化組分PBMP-3對單獨或有有絲分裂原刺激的脾細胞增殖均沒有促進作用,反而具有一定的免疫抑制作用。
　　 采用體外巨噬細胞模型研究分析了鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖及其純化組分

17、PBMP—1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3的免疫活性。鮑氏層孔菌菌絲體多糖具有提高腹腔巨嗜細胞酸性磷酸酶活性、增強腹腔巨嗜細胞吞噬中性紅能力,且這種作用與多糖濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)的量效關(guān)系。
　　 采用MTT法對鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖PBMP及其純化組分PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3在體外抑制人胃癌BGC-823細胞增殖作用進行研究。結(jié)果表明,鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖PBMP及其純化

18、組分PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3作用24、48、72 h,均能不同程度的抑制BGC-823細胞的增殖,且抑制作用與多糖之間存在明顯正相關(guān)的量效關(guān)系和時效關(guān)系。在50μg/ml濃度、作用72 h時,PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3等多糖組分對BGC-823的體外抑瘤率達到81.98％、90.68％、90.27％和90.05％,已經(jīng)接近陽性對照(順鉑,5μg/ml)的抑制率(95.30