青錢(qián)柳多糖的分離純化與結(jié)構(gòu)解析及其生物活性研究.pdf

1、青錢(qián)柳又名搖錢(qián)樹(shù)，系胡桃科青錢(qián)柳屬植物。它是我國(guó)特有的單種屬植物，廣泛分布于安徽、福建、湖北、湖南、江蘇、江西、四川、貴州、浙江等地的海拔420～2500m的山區(qū)，是國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的瀕危植物之一。其樹(shù)皮、樹(shù)葉可用于治療糖尿病、高血壓、高血脂。目前，青錢(qián)柳茶已得到美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)的認(rèn)可，是我國(guó)第一個(gè)獲得美國(guó)FDA頒發(fā)質(zhì)量證書(shū)的保健茶。本文以江西修水的青錢(qián)柳為實(shí)驗(yàn)材料，綜合應(yīng)用食品科學(xué)、有機(jī)化學(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)、分析化學(xué)、生物技術(shù)

2、及現(xiàn)代儀器分析等一系列現(xiàn)代研究方法和技術(shù)手段，較為系統(tǒng)地研究了從青錢(qián)柳中提取純化出來(lái)的青錢(qián)柳多糖。對(duì)該多糖的含量測(cè)定、提取純化、分子量、單糖組成、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及部分生物活性進(jìn)行了較深入的研究。本文對(duì)青錢(qián)柳多糖的提取、測(cè)定及生物學(xué)活性作用進(jìn)行了較深入的研究，為青錢(qián)柳多糖作為功能性食品基料和用于新藥開(kāi)發(fā)的研究奠定了基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)論概括如下： 1.將葸酮-硫酸法用于測(cè)定青錢(qián)柳多糖的含量。青錢(qián)柳用水提取，經(jīng)多級(jí)處理除去脂類(lèi)、單糖、雙

3、糖、低聚糖、氨基酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)制得青錢(qián)柳精制多糖，精制多糖溶解后與葸酮-硫酸試劑顯色，通過(guò)掃描確定最大吸收波長(zhǎng)，然后用精制多糖測(cè)得青錢(qián)柳多糖對(duì)葡萄糖的換算因子。結(jié)果表明，該測(cè)定方法簡(jiǎn)便可行，供試液在8 h內(nèi)顯色穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好，平均回收率為100.8％(RSD=1.90％，n=3)。所測(cè)江西修水青錢(qián)柳中多糖含量為4.387％。 2.將兩種植物活性成分提取技術(shù)應(yīng)用于青錢(qián)柳多糖的提取研究。以江西修水青錢(qián)柳粉末為原料，采用熱水浸提法

4、提取青錢(qián)柳多糖。研究了提取溫度、提取次數(shù)、提取時(shí)間和料液比對(duì)青錢(qián)柳多糖得率的影響，并以提取次數(shù)、提取時(shí)間和料液比為考察因素，在90℃下，采用L9(3<'3>)正交實(shí)驗(yàn)確定了熱水浸提法提取青錢(qián)柳多糖的最佳工藝參數(shù)，即提取次數(shù)為3次，提取時(shí)間為150 min，液料比為1：8。在上述提取條件下，熱水浸提法提取青錢(qián)柳多糖得率可達(dá)到6.54％。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box.Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，確定了超聲輔助提取青錢(qián)柳多

5、糖工藝的最佳條件，即固液比為1：8，溫度為58℃，時(shí)間為59 min，在此條件下青錢(qián)柳多糖理論提取值達(dá)到4.96％。 3.探討了青錢(qián)柳多糖的脫色工藝。青錢(qián)柳粗多糖色澤很深，呈黑褐色，影響其分離純化、化學(xué)結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理及構(gòu)效關(guān)系的研究。本文研究了活性炭吸附法用于青錢(qián)柳粗多糖液脫色的的效果，探索活性炭吸附法用于青錢(qián)柳多糖脫色的可行性。分別以粗多糖液脫色率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法對(duì)脫色的最佳工藝進(jìn)行優(yōu)選并考察活性炭吸附法對(duì)青錢(qián)柳粗多糖的

6、影響。結(jié)果表明，活性炭吸附法對(duì)青錢(qián)柳粗多糖液具有良好的脫色效果，脫色的最佳工藝條件為：溫度為40℃，吸附時(shí)間20 min，活性炭用量1.0％，pH值3.5。結(jié)論：活性炭吸附法用于青錢(qián)柳多糖的脫色效果良好，且簡(jiǎn)便易行。 4.研究了青錢(qián)柳多糖的純化工藝及理化性質(zhì)。本文首次運(yùn)用Sephacryl-400葡聚糖凝膠層析柱與大分子純化系統(tǒng)AKTA Puritier 100聯(lián)用對(duì)青錢(qián)柳精制多糖進(jìn)行純化，得到一個(gè)主要多糖組分，該組分在示差檢測(cè)

7、器上監(jiān)視的多糖吸收峰和紫外檢測(cè)到的蛋白質(zhì)特征吸收峰的最大值位置基本重疊，表明該組分可能是糖和蛋白的復(fù)合物，收集該組分，命名為CPC-1。將純化所得青錢(qián)柳多糖CPC-1，經(jīng)HPGPC法檢測(cè)為均勻?qū)ΨQ(chēng)單一色譜峰，以已知分子量的T-10、T-40、T-70、T-500標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖和藍(lán)色葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，采用HPGPC法測(cè)定了CPC-1的分子量，大小分別為1105859道爾頓。通過(guò)氨基酸自動(dòng)分析儀法測(cè)定CPC-1中氨基酸種類(lèi)及含量表明CP

8、C-1中含有17種氨基酸成分，其中天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和精氨酸含量較高。通過(guò)GC以及GC-MS測(cè)定分析，CPC-1為一雜多糖，它由六種單糖組成，分別是鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，通過(guò)GC測(cè)定分析其摩爾比為10.64：31.23：3.23：8.72：30.16：16.02；其中，阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖的含量較高，木糖含量最低。紅外光譜分析結(jié)果表明其具有典型的多糖特征吸收峰。 5.研究了青錢(qián)

9、柳多糖的生物活性，包括體外抗氧化實(shí)驗(yàn)、抑制α-淀粉酶活力以及抑菌實(shí)驗(yàn)。青錢(qián)柳多糖對(duì)OH·自由基、O<,2>·清除效果相對(duì)較低，但對(duì)二苯代苦味酰自由基(DPPH)有顯著清除作用，同時(shí)通過(guò)硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)得其對(duì)亞油酸具有抗氧化作用。青錢(qián)柳多糖對(duì)α-淀粉酶活力具有一定的抑制作用，當(dāng)青錢(qián)柳多糖濃度為1.0 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)13％。青錢(qián)柳多糖對(duì)α-淀粉酶活力的抑制作用均隨多糖濃度的增大而增加，這表明青錢(qián)柳的降血糖作用與青錢(qián)柳多糖的