錦南復(fù)方改善2型糖尿病模型大鼠胰島素抵抗及機(jī)制初探.pdf

1、目的:2型糖尿病是由于胰島素分泌相對不足或胰島素作用障礙所致的以血糖升高為主要特征的一種代謝性疾病，其中胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)的典型特征，也是T2DM的發(fā)病基礎(chǔ)。2型糖尿病是危害人類健康的嚴(yán)重的代謝性疾病，且發(fā)病率逐年攀升，2型糖尿病及其并發(fā)癥所導(dǎo)致的死亡率呈上升趨勢。現(xiàn)有治療2型糖尿病的主要措施包括飲食控制、運(yùn)動，在控制效果不佳的情況下選擇口服降糖藥物，必要時可用胰島素。大部分2型糖尿病患者服用口服降糖藥，如雙胍類

2、、磺酰脲類、噻唑烷二酮類藥物。但是長期服用可導(dǎo)致如白細(xì)胞減少、溶血性貧血、損傷消化道等不良反應(yīng)。近年來，中藥以其服用方便、安全低毒、調(diào)節(jié)血糖作用溫和等特點凸顯優(yōu)勢。
　　錦南復(fù)方(JNC)為蘇州太倉當(dāng)?shù)氐拿耖g驗方，對防治糖尿病、高血壓等具有重要意義。本論文旨在通過體內(nèi)、外實驗驗證錦南復(fù)方降低血糖、改善2型糖尿病胰島素抵抗的作用，并進(jìn)一步研究JNC對胰島素受體物-1絲氨酸磷酸化(p-IRS-1 Ser307)、磷酸酰肌醇-3-激酶（

3、PI3K）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT-4)蛋白表達(dá)的影響，初步探明JNC改善IR的作用機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分:HepG2細(xì)胞置于含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)。取傳代培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞，將細(xì)胞以103個/孔接種于96孔板，37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，PBS清洗1次，加入含有10μg/ml胰島素的培養(yǎng)基200μL，HepG2細(xì)胞于37℃，5％CO2條件培養(yǎng)24

4、 h，建立IR細(xì)胞模型。取IR模型細(xì)胞分別設(shè)為對照組、模型組、JNC高、中、低劑量組。JNC組分別加入120，60，30μg/ml JNC。每組設(shè)6個復(fù)孔，加入受試藥物24 h后通過葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法(GOD-POD)測定培養(yǎng)液的葡萄糖濃度，計算葡萄糖吸收率。采用MTT法檢測JNC對HepG2細(xì)胞增殖的抑制率。運(yùn)用Western-Blot法檢測p-IRS-1 Ser307、PI3K、GLUT-4表達(dá)，分析JNC干預(yù)對IR模型細(xì)胞

5、相關(guān)蛋白的影響。
　　第二部分:雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。按50 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)建立化學(xué)性損傷糖尿病大鼠模型，選擇空腹血糖值高于11.1 mmol/l的成模大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對照組(參芪顆粒300 mg/kg)、錦南復(fù)方高、中、低(300，150，75 mg/kg)3個劑量組，每組10只。分別灌胃給予受試藥與陽性對照藥，對照組、模型組灌胃等容量生理鹽水。實驗第3周，大鼠

6、禁食12h，進(jìn)行口服糖耐量實驗(OGTT)。末次給藥后禁食12h，不禁水，眼內(nèi)眥取血，分離血清4℃冰箱保存待測;分離并稱量:心、肝、脾、肺、腎臟組織，計算臟器系數(shù)。
　　第三部分:雄性SD大鼠，正常組（10只）給予基礎(chǔ)飼料，其余50只大鼠喂養(yǎng)高脂飼料4周后，按45 mg/kg體重腹腔注射STZ建立2型糖尿病大鼠IR模型。將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、JNC160 mg/kg組、JNC80 mg/kg組、JNC40 mg/kg組，陽性對

7、照二甲雙胍200 mg/kg組。各組繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)，并灌胃給予相應(yīng)的受試藥物，對照組給予基礎(chǔ)飼料。對照組與模型組灌胃給予等容積生理鹽水，每天上午給藥1次，連續(xù)干預(yù)4周，每周稱重1次，隨體重增減及時調(diào)整給藥量。至實驗第3周，禁食12小時，進(jìn)行口服糖耐量實驗。末次給藥后禁食12小時，眼內(nèi)眥取血，分離血清，檢測血糖、血脂、胰島素水平;取部分肝臟制備肝勻漿，離心分離上清，測定肝糖原水平;分離肝、胰腺組織制作切片，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)檢查，觀察有

8、無病理改變。使用免疫組化法測肝臟中GLUT-4、p-IRS-1 Ser307表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　第一部分: HepG2細(xì)胞置于含10μg/ml胰島素培養(yǎng)液孵育24 h，與對照組比較，葡萄糖吸收率下降，表明建模成功。模型細(xì)胞經(jīng)不同濃度的JNC干預(yù)，與模型組比較，葡萄糖吸收率顯著增加。模型細(xì)胞GLUT-4、PI3K蛋白表達(dá)顯著高于IR細(xì)胞，而p-IRS-1 Ser307水平則明顯受到抑制。給予不同劑量JNC干預(yù)后，GLU

9、T-4、PI3K蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，IRS-1Ser307磷酸化顯著受抑。
　　第二部分:與模型組比較，JNC150，75 mg/kg劑量組可顯著降低鏈佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠空腹血糖、餐后血糖升高，增強(qiáng)糖尿病模型大鼠的葡萄糖耐受能力。實驗期間，未見糖尿病大鼠行為活動異?，F(xiàn)象。
　　第三部分:JNC40、80、160 mg/kg劑量下可顯著降低糖尿病大鼠空腹血糖(FBG)、餐后血糖(PBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c);亦可

10、下調(diào)總膽固醇(TC)、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白(LDL-C)、游離脂肪酸(FFA)、空腹血清胰島素(FINS)、丙二醛(MDA)及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR);上調(diào)肝糖原(Hepatic glycogen)，GLUT_4表達(dá)，抑制IRS-1Ser307磷酸化水平，可有效改善糖尿病大鼠葡萄糖代謝及脂肪代謝。JNC各劑量組可有效改善模型大鼠受損的胰島β細(xì)胞的形態(tài)，改善胰島β細(xì)胞分泌胰島素的功能。此外，JNC3個劑量通過減少自由基以