通過調(diào)控ROS建立人乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞株及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過調(diào)控ROS建立人乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞株并研究其機(jī)制。
　　方法：通過DCFH-DA染色、激光共聚焦顯微鏡觀察MCF-7及其耐藥株MCF-7/ADM細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度及分布，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7及其耐藥株MCF-7/ADM細(xì)胞內(nèi)ROS含量差異。使用不同濃度H2O2、GSH作用不同時(shí)間，MTT法檢測(cè)阿霉素（ADM）對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定H2O2的造模濃度為0.001,0.01,0.1μmol/L，造模時(shí)間

2、為20周，耐藥性最高者命名為MCF-7/ROS細(xì)胞；選定GSH的造模濃度為0.001,0.01,0.1 mmol/L，造模時(shí)間為12周，耐藥性最高者命名為MCF-7/GSH細(xì)胞。采用MTT法測(cè)定各濃度阿霉素、紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶、長春新堿、氨魯米特、環(huán)磷酰胺對(duì)MCF-7/ROS細(xì)胞的抑制率，計(jì)算IC50及耐藥指數(shù)；SRB法檢測(cè)各濃度紫杉醇對(duì)MCF-7/GSH細(xì)胞的抑制率，計(jì)算IC50及耐藥指數(shù)。倒置顯微鏡下觀察所建耐藥細(xì)胞株的形態(tài)

3、學(xué)變化。運(yùn)用PI單染法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7、MCF-7/ADM、MCF-7/ROS、MCF-7/GSH細(xì)胞的周期分布。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所建耐藥細(xì)胞內(nèi)ROS的含量變化；高內(nèi)涵細(xì)胞術(shù)觀察ROS在MCF-7、MCF-7/ADM、MCF-7/ROS細(xì)胞內(nèi)的分布情況。采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞MRP1和P-gp表達(dá)的劑量依賴性及時(shí)間依賴性關(guān)系；激光共聚焦顯微鏡觀察MCF-7，MCF-7/ROS細(xì)胞中MRP1和P-gp的表達(dá)

4、及分布。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所建耐藥細(xì)胞對(duì)Rh123的累積能力?；瘜W(xué)法檢測(cè) MCF-7/ROS和MCF-7/GSH細(xì)胞內(nèi) GPx和 GSH的含量、SOD和 Catalase的活性變化。通過使用工具藥Y294002、PD98059、PDTC和Staurosporine，MTT法檢測(cè)MCF-7、MCF-7/ADM、MCF-7/ROS和MCF-7/GSH細(xì)胞對(duì)ADM耐藥性的變化；Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p-Akt、p-ERK、p-I-?

5、B、PKCα、P-gp、MRP1、GSTπ的表達(dá)，分析MCF-7/ROS和MCF-7/GSH細(xì)胞耐藥產(chǎn)生的機(jī)制。采用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè) MCF-7及 MCF-7/ROS細(xì)胞中耐藥相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2，NF-κB，HIF-1α的表達(dá)與分布。
　　結(jié)果：耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM內(nèi)ROS含量約為敏感株細(xì)胞的2.77±0.21倍，且呈均勻分布。長期孵育H2O2及GSH均可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥，且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。

6、其中0.1μmol/L的H2O2連續(xù)孵育20周及0.1 mmol/L的GSH連續(xù)孵育12周所誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥性最強(qiáng)；分別命名為MCF-7/ROS和MCF-7/GSH細(xì)胞。此后隨孵育時(shí)間延長，細(xì)胞耐藥性未出現(xiàn)顯著性改變。MCF-7/ROS細(xì)胞對(duì)阿霉素、紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶、長春新堿、氨魯米特、環(huán)磷酰胺的耐藥指數(shù)分別為13.99、4.61、5.32、1.73、8.80、4.06、3.49，MCF-7/GSH細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥指數(shù)為3.2

7、9。與MCF-7相比，MCF-7/ADM、MCF-7/ROS、MCF-7/GSH耐藥細(xì)胞的G2/M期所占比例有顯著增加，而MCF-7/GSH細(xì)胞S期所占比例則相對(duì)減少。流式細(xì)胞術(shù)及高內(nèi)涵細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明長期孵育H2O2及GSH均可降低MCF-7細(xì)胞內(nèi)的ROS含量。Western blot和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果表明，長期調(diào)控ROS可劑量、時(shí)間依賴性誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞表達(dá)MRP1和P-gp，且該外排蛋白主要分布于細(xì)胞膜上；此外，各模型

8、組細(xì)胞對(duì)Rh123的累積能力均顯著降低。與 MCF-7相比，MCF-7/ROS與MCF-7/ADM耐藥細(xì)胞內(nèi)GPx和GSH含量均高于敏感株，但SOD和Catalase活性與敏感株相比無顯著差異；MCF-7/GSH細(xì)胞則表現(xiàn)為GPx含量降低，而GSH含量與SOD、Catalase活性均有顯著升高。機(jī)制研究表明：PI3K、ERK、NF-κB和 PKC的抑制劑均可不同程度地逆轉(zhuǎn) MCF-7/ADM、MCF-7/ROS和MCF-7/GSH細(xì)胞的

9、耐藥性。其中，對(duì)于MCF-7/ROS細(xì)胞，LY294002、PD98059均可顯著下調(diào) MRP1、P-gp的表達(dá)；LY294002可顯著下調(diào) GSTπ的表達(dá)。對(duì)于 MCF-7/GSH細(xì)胞， LY294002、PDTC、PD98059可顯著下調(diào)MRP1的表達(dá)；LY294002、PDTC可顯著下調(diào)P-gp的表達(dá)；LY294002、Staurosporine可顯著下調(diào)GSTπ的表達(dá)。此外， MCF-7/ROS細(xì)胞中Nrf2， NF-κB，HI

10、F-1α的表達(dá)均顯著高于其敏感株MCF-7細(xì)胞，其中過量表達(dá)的Nrf2與HIF-1α均于核內(nèi)聚集。
　　結(jié)論：耐藥株MCF-7/ADM細(xì)胞內(nèi)ROS的含量顯著高于其敏感株MCF-7細(xì)胞。通過雙向調(diào)控ROS，對(duì)敏感MCF-7細(xì)胞長期孵育低劑量的H2O2和GSH，可分別建立MCF-7/ROS和MCF-7/GSH耐藥細(xì)胞模型，且該模型細(xì)胞均具有腫瘤多藥耐藥的特點(diǎn)。所建耐藥細(xì)胞特征主要體現(xiàn)為：細(xì)胞周期的變化、細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化、外排蛋白