重組人干擾素α-2b包涵體蛋白的柱層析復(fù)性研究.pdf

1、干擾素α-2b (IFNα-2b)是具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，具有抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞增生、調(diào)節(jié)人體免疫功能等作用。該蛋白在基因重組的大腸桿菌中以包涵體的形式表達(dá)，需經(jīng)體外重折疊復(fù)性恢復(fù)成具有天然構(gòu)象的活性蛋白。層析復(fù)性技術(shù)是近年來(lái)出現(xiàn)的一個(gè)新的復(fù)性方法，由于它能顯著地改進(jìn)復(fù)性產(chǎn)率，而且能將復(fù)性與分離純化合為一步，降低下游成本，所以是當(dāng)前生物技術(shù)中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。 本文采用層析復(fù)性方法，對(duì)重組人干擾素α-2b (rhIFN

2、α-2b)的復(fù)性進(jìn)行研究，并對(duì)復(fù)性條件進(jìn)行優(yōu)化，與常規(guī)的透析復(fù)性方法相比較，以期為蛋白質(zhì)復(fù)性提供一種簡(jiǎn)便且適宜大規(guī)模應(yīng)用的方法。 用5L發(fā)酵罐制備得到了重組人干擾素α-2b包涵體，經(jīng)過(guò)破胞離心，1L發(fā)酵液可以得到2.4g粗制包涵體。重組人干擾素α-2b包涵體經(jīng)多次洗滌后，溶于含6mol/L鹽酸胍的溶解液中，蛋白純度可達(dá)60％左右。 利用鹽酸胍濃度梯度體積排阻層析(SEC)法對(duì)重組人干擾素α-2b進(jìn)行復(fù)性。通過(guò)考察線性

3、鹽酸胍梯度下鹽酸胍終濃度、梯度長(zhǎng)度、流速、復(fù)性液中還原型/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比例等因素，探索了鹽酸胍梯度凝膠層析柱復(fù)性rhIFNα-2b的優(yōu)化條件。結(jié)果表明，復(fù)性后rhIFNα-2b的蛋白回收率是透析復(fù)性法的1.5倍，蛋白活性收率為68.7％，比活為1.77x10<'8>IU/mg，純度高達(dá)94％。 以鹽酸胍濃度梯度離子交換層析(IEC)作為蛋白質(zhì)復(fù)性系統(tǒng)，能有效地復(fù)性重組人干擾素α-2b，并在復(fù)性的同時(shí)對(duì)蛋白

4、進(jìn)行了純化。在流速為0.5ml/min，鹽酸胍終濃度1.5mol/L，上樣量為2．24mg的條件下，復(fù)性后重組人干擾素α-2b的比活為1.13x10<'8>IU/mg，蛋白回收率51.2％，蛋白活性收率為 46.3％，純度高于90％。 疏水層析(HIC)法復(fù)性重組人干擾素α-2b.當(dāng)流速為1ml/min，BufferA和Buffer B中鹽酸胍濃度為2mol/L，上樣量為0.644mg時(shí)，復(fù)性后rhIFNa-2b的比活為2.3