二烯丙基三硫和胱胺拮抗慢性正己烷中毒的效果及機制研究.pdf

1、研究目的：
　　正己烷（n-Hexane）是工業(yè)生產(chǎn)中一種常用的有機溶劑，主要用作粘合劑、油漆的生產(chǎn)原料，植物油的提取劑以及電子產(chǎn)業(yè)中的清潔劑。研究顯示長期低濃度的正己烷暴露可導(dǎo)致職業(yè)中毒的發(fā)生，以感覺運動型周圍神經(jīng)損傷為主要臨床特征。早期表現(xiàn)為肢體遠端發(fā)麻、刺痛、蟻走感，手足發(fā)涼多汗、觸覺減退，多成對稱性分布，進一步發(fā)展可表現(xiàn)為肌力減退、下肢行走困難，嚴重了造成肌肉萎縮和癱瘓。1957年意大利報道了首例制鞋工人正己烷神經(jīng)中毒的案

2、例，隨后日本、美國、加拿大、韓國、巴西等國家也相繼出現(xiàn)了集體性正己烷職業(yè)病中毒的報道。中國從上世紀70-80年代開始發(fā)生正己烷中毒，隨后逐年不斷增加。正己烷導(dǎo)致神經(jīng)病變的發(fā)生主要通過其代謝產(chǎn)物2，5-己二酮(2，5-HD)介導(dǎo)，但其分子機制至今尚不明確且無特效藥物治療。經(jīng)對癥治療，一般需半年至一年才能恢復(fù)健康，部分嚴重中毒病例不能完全恢復(fù)。由于正己烷慢性中毒患者以中青年居多，不僅嚴重損害了患者本人的身心健康，同時也給家庭和社會帶來了沉重

3、的經(jīng)濟負擔。因此，開發(fā)安全有效正己烷中毒防治藥物，既有利于其治療，又可進一步闡明其中毒機制，具有非常重要的理論和現(xiàn)實意義。
　　二烯丙基三硫(DATS)是大蒜的一種重要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗動脈粥樣硬化等多重功效，還能夠?qū)Χ喾NP450酶起到調(diào)節(jié)作用。實驗室之前的研究表明大蒜油對正己烷中毒具有保護作用，其機制與影響正己烷代謝和抵抗氧化應(yīng)激有關(guān)，而大蒜油中DATS的含量占到50％以上，因此DATS有可能是大蒜油發(fā)揮拮抗正己烷毒

4、性的活性成分。綜合DATS多重功效及其對代謝的調(diào)節(jié)作用，我們認為其可能是大蒜油拮抗正己烷中毒的活性成分。
　　胱胺是一種具有神經(jīng)保護作用的氨基二硫化物，對帕金森氏癥(PD)、亨廷頓氏病(HD)、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)等多種神經(jīng)退行性疾病具有很好的預(yù)防和治療作用。胱胺不但能夠促進神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，而且具有抗氧化、抑制神經(jīng)細胞凋亡、抵抗神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)等多重功效但是至今為止尚沒有關(guān)于胱胺預(yù)防和治療外源化學(xué)物引起的周圍神經(jīng)病變的報

5、道。
　　因此，本研究為了探討DATS和胱胺對正己烷神經(jīng)損傷的保護作用，分別通過正己烷和2，5-HD經(jīng)口灌胃染毒建立正己烷周圍神經(jīng)損傷模型，給予DATS和胱胺干預(yù)，通過相關(guān)行為學(xué)指標評價其干預(yù)效果;并進一步分別從代謝和分子生物學(xué)角度對DATS和胱胺發(fā)揮作用的機制進行了探討。最后，通過DATS和胱胺的聯(lián)合給藥，評價其共同拮抗正己烷中毒性周圍神經(jīng)病的效果。
　　研究方法：
　　1.DATS對慢性正己烷神經(jīng)損傷的保護作用

6、r>　　Wistar大鼠72只，隨機分為6組，即對照組、模型組、DATS對照組、低中高劑量DATS干預(yù)組。DATS對照組(30 mg/kg)和低中高劑量DATS組(10，20，30 mg/kg)動物每天經(jīng)口給予DATS，其余動物給予等體積玉米油;2h后，除對照組和DATS對照組外，其余動物經(jīng)口給予正己烷(3 g/kg)。每周染毒7天，連續(xù)染毒8周至模型組動物出現(xiàn)明顯癱瘓癥狀。每兩周測定一次四肢抓力，最后進行步態(tài)評分對DATS的干預(yù)效果進

7、行評價。
　　在染毒結(jié)束前一周，從模型組和DATS干預(yù)組中每組隨機選取6只大鼠，于正己烷暴露后每2h經(jīng)頸靜脈取血分離血清，連續(xù)10次，每次0.4 ml。通過氣相色譜法和埃利希反應(yīng)測定血清中的游離2，5-HD和吡咯加合物水平，采用DAS3.0對其毒代動力學(xué)參數(shù)進行分析。動物處死后，取肝、腎、腦、脊髓和坐骨神經(jīng)測定其中吡咯加合物的水平。
　　取肝臟組織，利用RIPA裂解液勻漿后，離心取上清Western Blot檢測肝臟中正己烷

8、代謝相關(guān)的CYP1A1、CYP1A2、CYP2B1/2和CYP2E1的蛋白含量。肝臟經(jīng)TMS緩沖液勻漿后超速離心制備微粒體，測定CYP1A1、CYP1A2、CYP2B1和CYP2E1的活性。
　　2.胱胺對慢性正己烷神經(jīng)損傷的保護作用
　　Wistar大鼠50只，隨機分為5組，即對照組、模型組、胱胺對照組、低高劑量胱胺干預(yù)組。胱胺對照組(60 mg/kg)、低高劑量胱胺組(30 mg/kg、60 mg/kg)動物經(jīng)腹腔注射給

9、予胱胺，其余動物給予等體積生理鹽水;2h后，除對照組和胱胺對照組外，其余動物經(jīng)口給予2，5-HD(300 mg/kg)。每周染毒6天，連續(xù)染毒6周至模型組動物出現(xiàn)明顯癱瘓癥狀。每周采用步態(tài)評分和加速轉(zhuǎn)棒試驗對胱胺的干預(yù)效果進行評價。
　　病理學(xué)檢查:大鼠經(jīng)麻醉后心臟灌注固定，制備坐骨神經(jīng)石蠟切片，行固藍染色觀察病理改變。
　　分別采用Elisa法檢測血清中BDNF的含量，實時熒光定量PCR檢測脊髓中BDNF mRNA的含量，

10、Westem blot檢測脊髓中BDNF、PI3K/Akt、Hsp-70蛋白的表達。
　　3.DATS和胱胺聯(lián)合作用對正己烷神經(jīng)損傷的保護效果
　　Wistar大鼠40只，隨機分為4組，即正己烷模型組、胱胺干預(yù)組、DATS干預(yù)組、DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組。胱胺干預(yù)組、DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組動物經(jīng)腹腔注射給予胱胺(60 mg/kg); DATS干預(yù)組、DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組經(jīng)口灌胃給予DATS(30 mg/kg);其余動物給予等

11、體積溶劑。2h后，各組動物均經(jīng)口給予正己烷(3 g/kg)。每周染毒7天，連續(xù)染毒8周至模型組動物出現(xiàn)明顯癱瘓癥狀，每兩周進行一次加速轉(zhuǎn)棒試驗和鼠尾電生理測試評價DATS和胱胺聯(lián)合作用對正己烷神經(jīng)損傷的保護效果。
　　研究結(jié)果：
　　1.DATS對慢性正己烷神經(jīng)損傷的保護作用
　　1.1 DATS對正己烷染毒大鼠行為學(xué)的影響
　　四肢抓力:與對照組相比，正己烷染毒大鼠自6周起開始出現(xiàn)明顯下降。染毒結(jié)束時，與模型組

12、相比低、中、高劑量DATS干預(yù)使得大鼠四肢抓力分別提升了7.9％，41.6％和63.1％(P＜0.05);
　　步態(tài)評分:染毒結(jié)束時，模型組大鼠步態(tài)出現(xiàn)明顯異常，步態(tài)評分升至3.25±0.87;10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg DATS干預(yù)組步態(tài)評分改善為3.17±0.83，2.33±1.07(P＜0.05),1.67±0.49(P＜0.01)。
　　1.2 DATS對正己烷染毒大鼠血清中2，5-HD和吡

13、咯加合物毒代動力學(xué)的影響與模型組大鼠相比，10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg DATS干預(yù)組2，5-HD曲線下面積(AUC0-t)分別下降了3.3％，17.1％和37.4％(P＜0.05)，而吡咯加合物曲線下面積下降了6.9％，7.0％和26.5％（P＜0.05）;血清中2，5-HD的最大濃度(Cmax)下降了11.7％，17.4％和30.3％，而吡咯加合物最大濃度(Cmax)下降了9.4％,9.4％和25.8％(P＜

14、0.05)。
　　1.3 DATS對正己烷染毒大鼠組織中吡咯加合物蓄積的影響
　　與模型組相比，DATS干預(yù)使得各組織臟器中蓄積的吡咯加合物出現(xiàn)了不同程度的下降:10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg DATS干預(yù)組大鼠肝臟中吡咯加合物下降了2.0％，5.6％和16.1％;腎臟中吡咯加合物下降了8.O％，21.6％和29.2％;大腦中吡咯加合物下降了9.9％，21.3％和22.3％;脊髓中吡咯加合物下降了19.

15、7％，24.4％和41.5％;坐骨神經(jīng)中吡咯加合物下降了10.0％，15.3％和27.1％。20 mg/kg、30 mg/kg DATS干預(yù)組大鼠腎臟、大腦、脊髓和坐骨神經(jīng)中吡咯加合物的下降均較模型組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05或P＜0.01)。
　　1.4 DATS對正己烷染毒大鼠肝臟中相關(guān)代謝酶含量的影響
　　與模型組相比，DATS干預(yù)使得CYP1A1的表達增加，CYP1A2、CYP2B1/2和CYP2E1的表達降低。1

16、0 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg DATS干預(yù)使肝臟中CYP1A1分別增加了0.3％、9.2％和54.2％(P＜0.05); CYP1A2降低了12.8％、24.5％和23.2％; CYP2B1/2降低了-6.9％、15.1％和27.4％(P＜0.01);CYP2E1降低了27.9％(P＜0.05)、32.1％(P＜0.05)和43.5％(P＜0.01)。
　　1.5 DATS對正己烷染毒大鼠肝臟中相關(guān)代謝酶活性

17、的影響
　　與模型組相比，DATS干預(yù)使得CYP1A1活性增強，CYP2B1和CYP2E1的活性減弱。其中20 mg/kg和30 mg/kg DATS干預(yù)使肝臟中CYP1A1活性增加了23.4％(P＜0.05)和29.5％(P＜0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;30 mg/kg DATS干預(yù)使得CYP2B1活性降低了23.1％(P＜0.01);10 mg/kg、20 mg/kg和30 mg/kgDATS干預(yù)使得CYP2E1分別降低了

18、25.6％、30.4％和39.9％，差異均具有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)。
　　2.胱胺對慢性正己烷神經(jīng)損傷的保護作用
　　2.1胱胺對2，5-HD染毒大鼠行為學(xué)的影響
　　步態(tài)評分:60 mg/kg和30 mg/kg胱胺干預(yù)組分別自第二周和第三周開始與模型組表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。染毒結(jié)束時，模型組7/10的大鼠完全癱瘓，30 mg/kg干預(yù)組1/10的大鼠完全癱瘓，60 mg/kg干預(yù)組未有完全

19、癱瘓的大鼠;30 mg/kg和60 mg/kg干預(yù)組大鼠的步態(tài)評分結(jié)果較模型組分別下降了24.3％(P＜0.01)和37.8％(P＜O.01)。
　　加速轉(zhuǎn)棒試驗:與模型組相比，60 mg/kg和30 mg/kg胱胺干預(yù)組分別自第3周和第5周開始與2，5-HD模型組表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。染毒結(jié)束時，模型組大鼠基本上不能在轉(zhuǎn)棒上停留，30 mg/kg和60 mg/kg干預(yù)組大鼠的潛伏期分別較模型組提升了216.8％(P＜

20、0.05)和325.7％(P＜0.01)。
　　2.2血清和脊髓組織中BDNF蛋白含量以及脊髓組織中BDNF mRNA含量的改變
　　與對照組相比，模型組血清中BDNF的含量降低了31.4％(P＜0.01)，脊髓中mature-BDNF的含量下降了37.6％（P＜0.01），脊髓中BDNF mRNA的含量降低了52.1％(P＜0.05)。與模型組相比，30 mg/kg和60mg/kg胱胺干預(yù)組血清中BDNF的含量分別提高了1

21、8.1％（P＜0.05）和38.9％(P＜0.01)，脊髓組織中precursor-BDNF的含量較模型組提高了8.2％和29.3％(P＜0.01)，mature-BDNF提高了107.2％(P＜0.01)和300.5％（P＜0.01），脊髓組織中BDNF mRNA含量約為模型組的2，1倍和2.7倍。
　　2.3脊髓組織中PI3K/Akt信號通路及Hsp-70蛋白含量的改變
　　與模型組相比，30 mg/kg、60 mg/k

22、g胱胺干預(yù)使得脊髓中p-PI3K/PI3K比率提升了110.6％和179.6％， p-Akt/Akt比率提升了112.7％，均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）;脊髓中Hsp-70的表達分別提高了21.1％和39.7(P＜0.05)。
　　3.DATS和胱胺聯(lián)合作用對正己烷神經(jīng)損傷的保護效果
　　加速轉(zhuǎn)棒試驗:胱胺干預(yù)組、DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組自第4周開始與模型組存在統(tǒng)計學(xué)差異;DATS干預(yù)組自第6周開始與模型組存在統(tǒng)計學(xué)差異;

23、DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組分別自第4周、第6周與DATS干預(yù)組、胱胺干預(yù)組存在統(tǒng)計學(xué)差異。至染毒結(jié)束時，DATS干預(yù)組、胱胺干預(yù)組和DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組潛伏期分別提升至模型組的2.7倍、3.3倍和5.2倍;DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組潛伏期較DATS干預(yù)組組提高了95.2％，較胱胺干預(yù)組提高了60.0％。
　　鼠尾電生理:DATS干預(yù)組、胱胺干預(yù)組和DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組分別自第6周、第6周和第4周開始與模型組出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異;DATS胱胺

24、聯(lián)合干預(yù)組自第4周與DATS干預(yù)組、胱胺干預(yù)組出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。染毒結(jié)束時DATS干預(yù)組、胱胺干預(yù)組和DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組NCV分別較模型組提升了19.8％、23.5％和51.3％; DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組潛伏期較DATS干預(yù)組組提高了26.3％，較胱胺干預(yù)組提高了22.5％。
　　結(jié)論：
　　1.DATS可有效拮抗慢性正己烷中毒所致的周圍神經(jīng)損傷，可能與其抑制正己烷代謝活化，促進其代謝解毒，降低2，5-HD的量有關(guān)。