正己烷對卵母細胞成熟和顆粒細胞凋亡的影響及其機制研究.pdf

1、正己烷(n-Hexane)是己烷(C6H14)主要異構體之一，在生產(chǎn)環(huán)境中主要以氣體形式經(jīng)呼吸道吸收。2,5-己二酮是其主要的活性代謝產(chǎn)物。正己烷常用作為提取植物油與合成橡膠的溶劑，職業(yè)性接觸機會較多（尤其是女工）。所以正己烷接觸所引起的女(雌)性生殖毒性損害應當引起人們高度的重視。本實驗研究正己烷對卵母細胞成熟與卵巢顆粒細胞凋亡的影響。以期為正己烷的卵巢毒性及其機理研究提供科學依據(jù)。同時，研究和建立HELMET 這一新的DNA 甲基化

2、檢測技術，為進一步開展環(huán)境化學物的生殖毒性的表觀遺傳毒理學研究奠定基礎。
　　 （一）正己烷對卵母細胞發(fā)育成熟的影響
　　 目的：通過雌性ICR小鼠卵母細胞體內(nèi)及體外培養(yǎng)實驗，探討正己烷及2，5-己二酮對卵母細胞發(fā)育成熟的影響方法1：清潔級雌性ICR小鼠40只，21天齡，13-15g,按體重分層，隨機分為4組，每組10只，染毒劑量分別為0、5.7、22.5、90.9ml/m3正己烷,靜式吸入染毒，8h/d，連續(xù)染毒7天。

3、染毒第6天注射PMSG10IU/ml。染毒結束后，取出卵母細胞，放入培養(yǎng)液中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后0小時及24小時，在倒置顯微鏡下觀察小鼠卵母細胞生發(fā)泡破裂率、第一極體釋放率、卵母細胞死亡率，在激光共聚焦電子顯微鏡下觀察線粒體膜電位及卵母細胞早期凋亡情況。
　　 方法2：成年雌性ICR小鼠40只，體重26-28g，按體重分層，隨機分為4組，每組10只，染毒劑量分別為0、5.7、22.5、90.9ml/m3,靜式吸入染毒，8h/d,連

4、續(xù)1周。染毒第5天注射PMSG10IU/ml，48小時后腹腔注射HCG8IU/ml。染毒結束后將雌性小鼠按照2:1與雄性小鼠同籠。觀察雌性小鼠陰栓出現(xiàn)情況，確認交配成功后，次日在倒置顯微鏡下計數(shù)2細胞受精卵數(shù)，第三日計數(shù)4細胞受精卵數(shù)目。
　　 方法3：清潔級雌性ICR小鼠40只，21天齡，注射PMSG10IU/ml，48小時后將其麻醉處死，取出卵母細胞，置培養(yǎng)液中，染毒2,5-己二酮，劑量分別為0、20、40及60mmol/L

5、。在倒置顯微鏡下觀察小鼠卵母細胞第一極體釋放率、生發(fā)泡破裂率、卵母細胞死亡率；在激光共聚焦電子顯微鏡下觀察線粒體膜電位及卵母細胞早期凋亡情況。
　　 （二）正己烷對卵巢顆粒細胞凋亡的影響及其機制
　　 目的：研究正己烷影響卵巢顆粒細胞凋亡及其可能機制，進一步探討正己烷的卵泡生長發(fā)育毒性機制。
　　 方法一：清潔級健康雌性ICR小鼠48只,6周齡，體重25-28g，按體重隨機分為4組，每組12只，染毒劑量分別為0、

6、5.7、22.5、90.9ml/m3正己烷,靜式吸入染毒，8h/d,連續(xù)染毒7天。染毒結束后取小鼠卵巢，固定，切片，分別采用電鏡及TUNEL 法觀察顆粒細胞凋亡；
　　 方法二：清潔級健康雌性ICR小鼠48只,6周齡，體重25-28g，按體重隨機分為4組，每組12只，染毒劑量分別為0、3.0、15.1、75.8ml/m3正己烷，靜式吸入染毒。每天4小時，每周7天，連續(xù)5周。染毒結束后取小鼠卵巢，固定，切片，分別采用電鏡及TUNE

7、L 法觀察顆粒細胞凋亡；采用Realtime RTPCR法檢測Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9mRNA的表達；采用Westernblot法檢測Fas、Bax及Bcl-2蛋白表達。
　　 （三）卵泡細胞DNA 甲基化檢測技術建立：HELMET
　　 目的：建立HELMET 實驗技術，檢測卵泡(主要是卵母細胞和顆粒細胞)DNA甲基化水平，為環(huán)境化學物生殖毒性的表觀遺傳學的進一步研究奠定基礎。

8、　　 方法：清潔級健康雌性Wistar大鼠10只, 12周齡。取卵巢組織固定，切片，HE 染色觀察各階段卵泡；5-甲基胞嘧啶免疫組織化學技術觀察各階段卵泡細胞5-甲基胞嘧啶甲基化水平；HELMEt技術觀察卵泡細胞CCGG及GATCG 序列甲基化水平。
　　 結論：
　　 根據(jù)以上結果，可得出如下結論：
　　 1．正己烷可抑制小鼠卵母細胞的發(fā)育成熟，包括核成熟與質(zhì)成熟。2,5-己二酮是正己烷影響卵母細胞核成熟的主

9、要活性代謝產(chǎn)物。
　　 2.卵母細胞線粒體的損傷及早期凋亡的出現(xiàn)，可能是正己烷抑制小鼠卵母細胞發(fā)育成熟的重要因素之一。
　　 3．正己烷可以誘導卵巢顆粒細胞凋亡，其可能機制主要是通過激活Bcl-2/Bax家族途徑，進而激活caspase家族途徑。
　　 4.HELMET 實驗方法可用于卵泡細胞不同序列的DNA 甲基化水平的檢測。
　　 5．卵泡發(fā)育的各個階段甲基化水平不一致，受精前成熟卵泡出現(xiàn)高度甲基化水