海洋嗜熱菌的篩選、熱穩(wěn)定脂肪酶性質(zhì)及其熱適應(yīng)機(jī)理研究.pdf

1、史前地球表面的一個(gè)特點(diǎn)是高溫炎熱，因此嗜熱性是一種原始生命的特性。生物的一個(gè)基本特征是對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，微生物作為地球上最早形成的第一類生命體征，對(duì)高溫的適應(yīng)能力尤為驚人?？梢韵胂笤诘厍虮砻鏈囟戎饾u降低的過程中會(huì)出現(xiàn)各種各樣的嗜溫細(xì)菌，嗜熱細(xì)菌則可能是嗜溫細(xì)菌適應(yīng)高溫環(huán)境的產(chǎn)物。 鑒于嗜熱菌在基因工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程及礦產(chǎn)資源的開發(fā)利用上均有很大的應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)前景，近些年來國內(nèi)外科研人員都對(duì)嗜熱菌的研究展示了極大興趣。

2、 本論文從太平洋深海熱液區(qū)和廈門近海溫泉分離到50株嗜熱菌，進(jìn)一步對(duì)它們的產(chǎn)脂肪酶能力進(jìn)行了篩選，其中TW-1產(chǎn)脂肪酶能力最強(qiáng)。在16S rDNA鑒定的基礎(chǔ)上，TW-1歸屬為Gebacillus sp.。隨后，對(duì)TW-1菌的脂肪酶基因進(jìn)行了克隆及在Escherichia coli中的表達(dá)。結(jié)果表明，該酶基因長1254bp，編碼417個(gè)氨基酸。重組脂肪酶的最適反應(yīng)溫度在40℃左右，在90℃時(shí)約有10％酶活。重組脂肪酶的最適pH值在

3、7-8，在pH6.0-9.0范圍內(nèi)保留80-100％的活性。該酶在1mM的變性劑(EDTA，2-ME，SDS，PMSF或DTT)和0.1％的去污劑(Tween 20，Chaps或Triton X-100.)作用下，EDTA、2-ME、SDS可以抑制大約18-30％的重組脂肪酶及粗酶活性，DTT和PMSF對(duì)酶活基本無影響。0.1％Tween 20、Chaps和的TritonX-100對(duì)粗酶酶活幾乎無什么影響，而對(duì)重組脂肪酶的酶活有5-10

4、％的抑制。在ImM或5mM的Ca2+，Mg2+，Zn2+，I mM的Fe2+and Fe3+作用下，酶活均增強(qiáng)到了103-283％，1 mM的LiCI，CuCl2或MnCl+對(duì)酶活有輕微的抑制，5 mM的CuCl2或MnCl2作用下完全測(cè)不到酶活。Fe2+，F(xiàn)e3+形成沉淀，無法測(cè)定脂肪酶活性。本研究提供了一種快速、有效、大量獲取高溫脂肪酶的方法，在工業(yè)上具有廣泛應(yīng)用前景。 為了探索嗜熱菌的熱適應(yīng)性機(jī)理，本文以近海溫泉分離獲得

5、的Thermusthermophilus WL為材料，采用蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究。根據(jù)已測(cè)序T.thermophilus的基因組序列，建立其開放閱讀框(ORF)數(shù)據(jù)庫。通過不同溫度下全菌蛋白的SDS-PAGE及Trieine-SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，圖譜以最適生長溫度(70℃左右)為分界線呈兩種帶型，低于最適生長溫度為一種帶型，等于或高于生長溫度為另一種帶型。將其中l(wèi)l條差異明顯的條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，在ORF數(shù)據(jù)庫比對(duì)后獲得相應(yīng)的基因。為了

6、尋找更多與熱適應(yīng)性相關(guān)的蛋白，進(jìn)一步采用雙向電泳對(duì)55℃75℃兩個(gè)溫度下的全菌蛋白樣品進(jìn)行分析，將75℃條件下蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)的10個(gè)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共有17種蛋白在高溫下上調(diào)表達(dá)。對(duì)差異表達(dá)蛋白相應(yīng)的基因進(jìn)行標(biāo)記，采用Northem blot檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄量，結(jié)果17種基因均明顯上調(diào)表達(dá)，與蛋白電泳圖譜結(jié)果一致。對(duì)高溫差異表達(dá)的超氧化物岐化酶、延胡索酸水化酶、轉(zhuǎn)錄與釋放因子基因進(jìn)行重組表達(dá)及抗體制備后，利用West

7、ern blot進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果可檢測(cè)到3種基因的表達(dá)產(chǎn)物。Northem blot和Western blot分析證實(shí)了蛋白質(zhì)組學(xué)的分析結(jié)果。 從17個(gè)基因中選擇SOD進(jìn)行基因功能研究，利用基因插入失活手段將耐高溫的卡那霉素編碼基因插入SOD基因中間，構(gòu)建SOD突變株。通過含卡那霉素平板在65℃下篩選突變株，獲得SOD基因失活的突變株。提取突變株基因組DNA，經(jīng)PCR檢測(cè)正確后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明構(gòu)建的突變株正確。

8、標(biāo)記卡那霉素編碼基因，對(duì)突變株進(jìn)行Northern blot，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卡那霉素基因有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；以SOD特異的抗體進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果SOD突變株中檢測(cè)不SOD。在上述試驗(yàn)證實(shí)SOD突變株正確的前提下，測(cè)定突變株的生長曲線。結(jié)果顯示，突變株與野生型菌株相比，最適生長溫度下降，最高生長溫度也下降Ts"c，從80℃下降到75℃為了證明溫度下降與SOD缺失有關(guān)，向培養(yǎng)基中添加不同濃度的重組SOD，發(fā)現(xiàn)在接種12d,時(shí)左右后，突

9、變菌株在80℃下恢復(fù)生長。這些結(jié)果說明，SOD與嗜熱菌的熱適應(yīng)性有關(guān)。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明17種蛋白與嗜熱菌的熱適應(yīng)性有關(guān)，為了了解這些蛋白通過何種途徑參與熱適應(yīng)性，本文選用SOD進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)互作研究。采用免疫共沉淀技術(shù)，從T.thermophilus WL中獲得與其結(jié)合的蛋白，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為2-酮異戊酸脫氫酶亞基。2-酮異戊酸脫氫酶基因重組表達(dá)，純化重組蛋白制備抗體，Western blot結(jié)果表明，與SOD結(jié)合的蛋白是2

10、-酮異戊酸脫氫酶。利用細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)，將SOD和2-酮異戊酸脫氫酶相應(yīng)的基因克隆在質(zhì)粒中，隨后共轉(zhuǎn)化，通過選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，SOD和2-酮異戊酸脫氫酶存在相互作用。將2-酮異戊酸脫氫酶亞基進(jìn)行分段克隆，以尋找特異的作用區(qū)域，結(jié)果表明，它只在整個(gè)分子水平發(fā)生相互作用。上述結(jié)果表明，SOD通過能量代謝途徑采用嗜熱菌的熱適應(yīng)反應(yīng)。 通過以上的研究發(fā)現(xiàn)，參與嗜熱菌熱適應(yīng)的蛋白主要是能量代謝相關(guān)蛋白、染色體穩(wěn)定性相關(guān)蛋白、