一株嗜熱芽孢桿菌脂肪酶基因的克隆表達(dá)以及重組酶酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用的研究.pdf

1、通過(guò)PCR得到Geobacillus stearothermophilus JC脂肪酶基因lipjC的全長(zhǎng)，測(cè)序發(fā)現(xiàn)該基因包含長(zhǎng)為1251bp的開(kāi)放閱讀框，編碼388個(gè)氨基酸殘基及一個(gè)由28個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。將脂肪酶基因全長(zhǎng)和編碼成熟肽的片段同時(shí)克隆到原核表達(dá)載體pET-28a（+），將轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）并在同樣的條件下誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)包含成熟肽的重組菌的表達(dá)水平（52030U/L）明顯高于包含前體（12100U/L

2、）的重組菌，說(shuō)明切除信號(hào)肽能顯著提高表達(dá)水平并獲得更多的可溶性蛋白。 重組菌體經(jīng)超聲破碎，含可溶性目的蛋白的上清液通過(guò)一步固定化金屬離子親和層析得到電泳單一條帶的純酶，比活為515.6 U/㎎，活力回收率為40.5％。純化的酶經(jīng)SDS-PAGE分析，表明其大小約為43kDa，符合預(yù)期計(jì)算值。 酶學(xué)性質(zhì)研究表明該重組脂肪酶反應(yīng)的最佳溫度為55℃，最佳pH為9.0。脂肪酶JC在許多抑制劑如EDTA、β-巰基乙醇、PMSF、D

3、TT中都能保持穩(wěn)定，Triton X-100對(duì)該酶有明顯的激活作用。在1mM的終濃度下，K+，Na+，Mg2+，Ca2+、Mn2+能激活該酶，而Fe2+，Zn2+，Cu2+對(duì)酶存在抑制作用。在有機(jī)溶劑如DMSO、乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮、丁酮、乙睛等存在下，脂肪酶的活力沒(méi)有顯著的下降，表明該脂肪酶具有較好的有機(jī)溶劑耐受性。 以重組脂肪酶JC為催化劑，進(jìn)行外消旋乙酸苯乙酯的拆分研究。在25℃，R-苯乙醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到92％左右，得到e