LOC101929897活化NF-κB途徑促進(jìn)肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制.pdf

1、在全球范圍內(nèi)，肺腺癌的發(fā)病率、死亡率均位于癌癥之首，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代的來臨，肺腺癌的研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向基于腫瘤分子特性的靶向治療，因此闡明肺腺癌復(fù)雜的分子機(jī)制已成為肺腺癌研究的主流趨勢(shì)，而關(guān)鍵基因和關(guān)鍵信號(hào)途徑異常是肺腺癌分子機(jī)制的主要研究對(duì)象。且肺腺癌組織細(xì)胞多在早期即伴有NF-κB信號(hào)途徑的激活[1，2]，并與肺腺癌TNM分期和較差的預(yù)后密切相關(guān)[2，3]。盡管對(duì)于NF-κB信號(hào)途徑激活的詳細(xì)分子機(jī)制尚未完全了解，但通過各種途徑抑制NF-

2、κB可抑制肺腺癌細(xì)胞的生長增殖，已被大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明[4，5]。因此干預(yù)NF-κB信號(hào)途徑已成為肺腺癌靶向治療的策略之一。
　　lncRNA(long non-coding RNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200nt的RNA，主要由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，多具有5'帽和多聚腺苷酸尾，無蛋白質(zhì)編碼功能或僅編碼微肽。因具有相對(duì)較長的核苷酸鏈，lncRNA可在分子內(nèi)折疊形成許多特定復(fù)雜的二級(jí)空間結(jié)構(gòu)，能提供多個(gè)與分子結(jié)合的位點(diǎn)，共同發(fā)揮生物學(xué)功

3、能，同時(shí)也造成了lncRNA復(fù)雜多樣的調(diào)節(jié)功能機(jī)制[6]。目前僅有少部分lncRNA的結(jié)構(gòu)和功能得到了研究。
　　近年來，關(guān)于lncRNA參與NF-κB信號(hào)途徑調(diào)控的研究已陸續(xù)開展。2015年，Krawczyk等鑒定了一個(gè)新的lncRNA PACER。通過直接作用，PACER促進(jìn)抑制型的p50/p50二聚體被激活型的p65/p50二聚體取代，結(jié)合結(jié)構(gòu)基因COX2的啟動(dòng)子，從而激活該基因轉(zhuǎn)錄[7]。因此lncRNA不僅參與NF-κB

4、信號(hào)途徑的調(diào)控，其本身更應(yīng)看作NF-κB信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的組成成分，目前這方面的研究剛剛開始，更多l(xiāng)ncRNA和NF-κB信號(hào)途徑的關(guān)聯(lián)性有待發(fā)掘。同時(shí)，病理情況下，lncRNA本身的表達(dá)或功能異?？赡芤餘F-κB信號(hào)途徑的功能異常，因此對(duì)NF-κB信號(hào)途徑相關(guān)lncRNA的篩選鑒定，可能拓展對(duì)NF-κB異常激活的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，且為肺腺癌患者的個(gè)體化治療提供更多可能的候選靶點(diǎn)。而在肺腺癌中，lncRNA LOC101929897對(duì)NF-κB

5、經(jīng)典途徑的作用還未有人研究。
　　第一部分LOC101929897通過上調(diào)IKKβ活化經(jīng)典NF-κB途徑，促進(jìn)肺腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究
　　研究目的:明確lncRNA LOC101929897是否通過上調(diào)并激活I(lǐng)KKβ，進(jìn)而激活經(jīng)典的NF-κB信號(hào)途徑，從而促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。
　　1、芯片檢測(cè)
　　利用芯片檢測(cè)三對(duì)肺腺癌和癌旁正常組織標(biāo)本中l(wèi)ncRNA和mRNA表達(dá)譜的改變，分析芯片結(jié)果，篩選其中差異表達(dá)的l

6、ncRNAs，芯片結(jié)果顯示:相比癌旁正常組織，在肺腺癌組織中有585個(gè)lncRNA表達(dá)上調(diào)，有2294個(gè)lncRNA表達(dá)下調(diào)，且有835個(gè)mRNA表達(dá)上調(diào)，有845個(gè)mRNA表達(dá)下調(diào)，其中，lncRNA LOC101929897和IKKβ表達(dá)同步上調(diào)。
　　2、標(biāo)本驗(yàn)證
　　提取上述三對(duì)肺腺癌和癌旁正常組織標(biāo)本的總RNA和總蛋白，應(yīng)用qRT-PCR、Western blotting驗(yàn)證LOC101929897、IKKβ mR

7、NA的表達(dá)水平是否與芯片結(jié)果一致，結(jié)果顯示:肺腺癌組織相較于癌旁正常組織，均呈現(xiàn)LOC101929897和IKKβ的表達(dá)同步上調(diào)。
　　3、LOC101929897、IKKβ在肺腺癌細(xì)胞中的基礎(chǔ)表達(dá)以及NF-κB基礎(chǔ)活性檢測(cè)。01)用qRT-PCR、Northern blotting檢測(cè)比較多個(gè)肺腺癌細(xì)胞株與肺正常上皮細(xì)胞株的LOC101929897、IKKβ mRNA表達(dá)水平，Western blotting檢測(cè)比較IKKβ的表

8、達(dá)水平，結(jié)果顯示:肺腺癌細(xì)胞株相對(duì)于肺正常上皮細(xì)胞株均呈現(xiàn)IKKβ和LOC101929897的同步上調(diào)，且上調(diào)程度與肺腺癌細(xì)胞的惡性程度呈正相關(guān)。
　　2)應(yīng)用報(bào)告基因分析和凝膠滯留法(EMSA)檢測(cè)比較多個(gè)肺腺癌細(xì)胞株和肺正常上皮細(xì)胞株的NF-κB基礎(chǔ)活性，結(jié)果顯示:NF-κB的活性增強(qiáng)與LOC101929897、IKKβ上調(diào)趨勢(shì)一致，且與肺腺癌細(xì)胞的惡性程度呈正相關(guān)。
　　4、LOC101929897通過上調(diào)IKKβ激活

9、經(jīng)典的NF-κB信號(hào)途徑
　　根據(jù)3的結(jié)果，構(gòu)建LOC101929897及其反義鏈表達(dá)載體，設(shè)計(jì)合成LOC101929897S的siRNA。選取LOC101929897相對(duì)低表達(dá)的A549細(xì)胞和相對(duì)高表達(dá)的HCC827細(xì)胞，在前者過表達(dá)LOC101929897，在后者干擾LOC101929897表達(dá)，進(jìn)行功能獲得和功能缺失分析，qRT-PCR檢測(cè)LOC101929897和IKKβ mRNA的表達(dá)改變; Western blotti

10、ng檢測(cè)總IKKβ、P-IKKβ、總IκBα、P-IκBα的含量變化;EMSA檢測(cè)NF-κB的核內(nèi)遷移，結(jié)果顯示:與表達(dá)LOC101929897反義鏈的陰性參照相比，過表達(dá)LOC101929897的A549細(xì)胞，其總IKKβ、pIKKβ升高，總IκBα降低，pIκ Bα升高，NF-κB核內(nèi)遷移增多;反之，在HCC827細(xì)胞敲低LOC101929897的表達(dá)，上述結(jié)果與過表達(dá)LOC101929897相反。
　　5、LOC101929

11、897促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移，抑制凋亡的作用研究在LOC101929897過表達(dá)和干擾的肺腺癌細(xì)胞中，采用MTT、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)、Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)LOC101929897對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力、遷移能力的影響，結(jié)果顯示:與表達(dá)LOC101929897反義鏈的陰性參照相比，過表達(dá)LOC101929897的A549細(xì)胞，增殖、遷移能力增強(qiáng)，細(xì)胞周期無明顯變化;反之，在HCC827細(xì)胞敲低LOC

12、101929897的表達(dá)，細(xì)胞增殖、遷移能力減弱，細(xì)胞周期無明顯變化。
　　結(jié)論:LOC101929897通過上調(diào)IKKβ活化經(jīng)典NF-κB途徑，從而促進(jìn)肺腺癌發(fā)生發(fā)展。
　　第二部分初步確定LOC101929897在肺腺癌中上調(diào)IKKβ的分子機(jī)制
　　研究目的:初步確定LOC101929897是否作為ceRNA，通過與IKKβ mRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-4741，增強(qiáng)IKKβ mRNA的穩(wěn)定性，從而上調(diào)IKKβ。

13、>　　研究方法和結(jié)果:
　　1、確定LOC101929897對(duì)IKKβ的上調(diào)作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平
　　1)亞細(xì)胞定位:分別提取肺腺癌細(xì)胞A549、H1299和HCC827的細(xì)胞核和細(xì)胞漿RNA，利用qRT-PCR進(jìn)行絕對(duì)定量，測(cè)定LOC101929897在核漿分布比例;利用RNA熒光原位雜交，制備A549、H1299和HCC827細(xì)胞涂片，用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)LOC101929897的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示: LOC1019

14、29897大部分位于細(xì)胞漿中，少部分位于細(xì)胞核中。
　　2)生物信息學(xué)分析:應(yīng)用RegRNA2.0、TargetScan7.1分析LOC101929897序列，發(fā)現(xiàn)無ORF，包含miR-512-5p和miR-4741應(yīng)答元件，同時(shí)miR-4741也靶向IKKβ mRNA。
　　3)用Act-D處理A549、H1299、HCC827細(xì)胞，提取總RNA，qRT-PCR測(cè)定IKKβ mRNA的半衰期，結(jié)果顯示:在三種細(xì)胞中，A54

15、9的IKKβ mRNA半衰期時(shí)間為3.4h，H1299為8.2h，HCC827為13.7h。
　　4)在A549中過表達(dá)LOC10192989724h后，用Act-D處理細(xì)胞，提取總RNA，測(cè)定IKKβ mRNA的半衰期，結(jié)果顯示:對(duì)照組A549中IKKβ mRNA的半衰期時(shí)間為3.3h，過表達(dá)LOC101929897后，IKKβ mRNA的半衰期為8.7h。
　　5)構(gòu)建pGL4.10[luc2]-pIKB KB重組質(zhì)粒，

16、在A549和HCC827中分別以pcDNA3.1(+)，非特異性干擾RNA(nc)分別作為陰性參照，在A549中過表達(dá)LOC10192989724h，HCC827中干擾LOC101929897表達(dá)24h后，再瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pGL4.10[luc2]-p IKB KB，pRL-TK作為內(nèi)參，測(cè)定雙熒光素酶活性，結(jié)果顯示:和陰性對(duì)照相比，過表達(dá)或者干擾LOC101929897后，兩種細(xì)胞中pGL4.10[luc2]-pIKBKB的活性無明顯變化。

17、
　　2、初步判斷LOC101929897是一個(gè)ceRNA
　　1)提取A549、H1299、HCC827細(xì)胞的總RNA，用qRT-PCR檢測(cè)miR-4741和miR-512-5p的相對(duì)含量，結(jié)果顯示:在三種細(xì)胞中miR-4741無明顯變化;miR-512-5p在A549中含量最高，在HCC827中最低。
　　2)用Act-D處理A549、H1299、HCC827細(xì)胞，提取總RNA，測(cè)定LOC101929897的半衰期

18、，結(jié)果顯示:A549的LOC101929897半衰期為6.6h，H1299為9.3h，HCC827為13.7h。
　　3、LOC101929897作為ceRNA的分子機(jī)制研究
　　用miR-512-5p inhibitor瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HCC827，用miR-512-5p mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染H1299，提取總RNA和總蛋白，用qRT-PCR檢測(cè)IKKβ和LOC101929897，Western檢測(cè)IKKβ蛋白水平，結(jié)果顯示:在H