AGEs通過CaMKIV、p38MAPK、NF-κB途徑促進(jìn)Jurkat細(xì)胞分泌IFN-γ.pdf

1、目的:晚期糖化終產(chǎn)物(AGEs)通過與特異性受體晚期糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合,損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)白細(xì)胞黏附、刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖、促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)等而加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)AGEs通過RAGE,p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK),核因子-κB(NF-κB)途徑,促進(jìn)Jurkat細(xì)胞分泌腫瘤壞死因а(TNF-а)、干擾素-γ(IFN-γ),并引起鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶IV(CaMKIV)表達(dá)增加

2、,因此本研究將進(jìn)一步觀察CaMKIV在AGEs誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞分泌IFN-γ中的作用,探討RAGE胞內(nèi)信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用的信號(hào)分子。
　　方法:①常規(guī)方法制備AGEs。200μg/ml的AGEs作用于植物血球凝集素(PHA)(0.25μg/ml)預(yù)刺激48h后的jurkat細(xì)胞0、30、60min后,蛋白免疫印跡法(Western blot)分別檢測胞漿及胞核CaMKIV的表達(dá),計(jì)算CaMKIV的核漿比值,同時(shí)設(shè)RAGE抗體

3、(1μg/ml)干預(yù)組、非特異性抗體IgG(1μg/ml)及牛血清白蛋白(BSA)(200μg/ml)對照組。②200μg/ml的AGEs作用于CaMKIV抑制劑(KN62)(10μM)預(yù)處理的Jurkat細(xì)胞24h,ELISA檢測IFN-γ表達(dá)。③200μg/ml的AGEs作用于KN62(10μM)預(yù)處理的Jurkat細(xì)胞30min,Western blot檢測檢測IκB磷酸化表達(dá)水平。④200μg/ml的AGEs作用于KN62(10

4、μM)預(yù)處理的Jurkat細(xì)胞30min,Western blot檢測檢測p38MAPK磷酸化水平的影響。
　　結(jié)果:①200μg/ml的AGEs作用于PHA預(yù)刺激的jurkat細(xì)胞30、60min后,Westernblot結(jié)果顯示CaMKIV的核漿比值增大,提示AGEs能引起CaMKIV發(fā)生核轉(zhuǎn)位,與BSA組及PHA對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);RAGE抗體能抑制AGEs誘導(dǎo)的CaMKIV核轉(zhuǎn)位(P<0.05),

5、而非特異性抗體IgG不能抑制AGEs誘導(dǎo)的CaMKIV核轉(zhuǎn)位。②200μg/ml的AGEs作用于PHA預(yù)處理的Jurkat細(xì)胞24h后,IFN-γ的表達(dá)較BSA組及PHA組明顯增多(P<0.01),KN62能抑制AGEs誘導(dǎo)的IFN-γ的表達(dá)(P<0.05)。③200μg/ml的AGEs作用于PHA預(yù)處理的Jurkat細(xì)胞30min后,p-IκB表達(dá)較BSA組及PHA組明顯增多(P<0.01),KN62能抑制AGEs上調(diào)p-IκB(P<

6、0.05)。④200μg/ml的AGEs作用于PHA預(yù)處理的Jurkat細(xì)胞30min后,p-p38MAPK表達(dá)較BSA組及PHA組明顯增多(P<0.01),KN62能抑制AGEs誘導(dǎo)的p-p38MAPK的表達(dá)(P<0.01)。
　　結(jié)論:AGEs可通過RAGE誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞CaMKIV的活化,并且通過RAGE-CaMKIV引起NF-κB的激活及炎癥因子IFN-γ的分泌,進(jìn)一步研究證實(shí)CaMKIV與p38MAPK通路存在串話