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文檔簡介
1、血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,ECs)與血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)之間的信息交流,在動脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的過程中具有至關(guān)重要的作用,而血管重建(remodeling)是心血管疾病共同的發(fā)病基礎(chǔ)和基本的病理過程。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示,低切應(yīng)力(low shear stress,LowSS)誘導(dǎo)ECs合成和分泌多種生物活性物質(zhì),其中包括血小板源
2、性生長因子(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB),PDGF-BB通過旁分泌機(jī)制作用于VSMCs,調(diào)控其增殖功能,從而誘導(dǎo)血管重建的發(fā)生。
近來研究表明,部分microRNAs(miRs),如miR-1和miR-34a在心血管組織中特異性表達(dá),并在心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有不可替代的作用。然而,miR-1和miR-34a是否參與上述過程及其機(jī)制目前尚不清楚?;诖?,本文探討了不同
3、切應(yīng)力條件下ECs合成分泌的PDGF-BB對 VSMCs的miRs表達(dá)的影響,以及在調(diào)控VSMCs增殖中的可能分子機(jī)制。
應(yīng)用細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)平行平板流動腔系統(tǒng)對與 VSMCs聯(lián)合培養(yǎng)的ECs施加15 dyn/cm2的正常切應(yīng)力(normal shear stress,NSS)和5 dyn/cm2的LowSS,加載時間為12 h;Western blotting檢測聯(lián)合培養(yǎng) VSMCs的細(xì)胞核增殖抗原(proliferating
4、cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表達(dá),以此反映細(xì)胞增殖能力;Real-time PCR檢測聯(lián)合培養(yǎng)ECs的PDGF-BB以及VSMCs的miR-1和miR-34a的表達(dá)變化;通過TargetScan、miRWalk等網(wǎng)站分別預(yù)測miR-1和miR-34a的下游靶蛋白;Western blotting檢測聯(lián)合培養(yǎng)VSMCs的miR-1下游靶蛋白-鋅指轉(zhuǎn)錄因子4(kruppel-like factor4,Klf4)和
5、miR-34a的下游靶蛋白-叉頭蛋白家族轉(zhuǎn)錄因子J2(forkhead box j2,F(xiàn)oxj2)的表達(dá)變化;靜態(tài)條件下應(yīng)用PDGF-BB重組蛋白刺激體外培養(yǎng)的大鼠VSMCs12 h,Western blotting檢測Klf4、Foxj2和PCNA的表達(dá)變化,Real-time PCR檢測VSMCs的miR-1和miR-34a表達(dá)變化;最后通過轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),分別上調(diào)和抑制VSMCs的miR-1和miR-34a表達(dá),Western blot
6、ting檢測相應(yīng)靶蛋白和PCNA的表達(dá)變化,驗(yàn)證miR-1對Klf4以及miR-34a對Foxj2的負(fù)調(diào)控作用。
結(jié)果顯示:①與 NSS相比,LowSS促進(jìn)了聯(lián)合培養(yǎng) ECs的PDGF-BB表達(dá)以及聯(lián)合培養(yǎng)VSMCs的PCNA表達(dá);② PDGF-BB重組蛋白刺激VSMCs,引起VSMCs的PCNA表達(dá)升高,促進(jìn)VSMCs增殖;③通過TargetScan和miRWalk等網(wǎng)站預(yù)測miR-1的下游靶蛋白為Klf4,miR-34a的
7、下游靶蛋白為Foxj2;④用PDGF-BB重組蛋白刺激VSMCs,VSMCs的miR-1表達(dá)顯著下調(diào),Klf4表達(dá)升高;miR-34a表達(dá)顯著上升,F(xiàn)oxj2表達(dá)降低;⑤上調(diào)VSMCs的miR-1和miR-34a表達(dá)水平,Klf4和Foxj2的表達(dá)均降低,抑制 VSMCs的miR-1和miR-34a表達(dá),Klf4和Foxj2的表達(dá)均上調(diào),且PCNA的表達(dá)也發(fā)生相應(yīng)的變化;⑥與NSS相比,LowSS導(dǎo)致聯(lián)合培養(yǎng)VSMCs的miR-1表達(dá)顯
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