器官型海馬腦片水平抑制蛋白酶體的活性對(duì)tau蛋白代謝的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、動(dòng)物和植物體內(nèi)的生命活動(dòng)幾乎都要受到蛋白質(zhì)降解的調(diào)控。研究表明蛋白酶體(proteasome)的活性受到抑制時(shí)，tau蛋白聚集顯著增加，蛋白酶體功能下降與tau蛋白的代謝密切相關(guān)，但其確切機(jī)制尚待研究。本研究以小鼠器官型海馬腦片為模型，研究抑制蛋白酶體的活性對(duì)微管相關(guān)蛋白tau代謝的影響，并以Akt/GSK-3β信號(hào)通路為靶標(biāo)，探討其內(nèi)在的機(jī)制。方法:將出生后2周的昆明小鼠脫臼處死后，急性分離雙側(cè)海馬并制備厚度為400μm的器官型海馬腦

2、片，培養(yǎng)不同時(shí)間(0、6、12、24、36、48和72hr)后，測(cè)定培養(yǎng)基內(nèi)乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)的水平來(lái)判斷海馬腦片的活性，確定最佳培養(yǎng)和給藥處理時(shí)間;海馬腦片培養(yǎng)48hr后，用35μM的放線菌酮(eycloheximide，CHX)和不同濃度蛋白酶體的可逆性抑制劑MG132(2.5和5μM)同時(shí)處理腦片6hr，通過免疫印跡技術(shù)測(cè)定tau蛋白的表達(dá)和磷酸化程度及其微管結(jié)合功能的改變，同時(shí)檢測(cè)了該

3、反應(yīng)體系中蛋白激酶B(proteinkinaseB，PKB/Akt)、糖原合酶激酶-3β（glycogensynthase-3β，GSK-3β）活性的變化以及熱休克蛋白90(heatshockprotein90，HSP90)含量的改變;此外，還利用免疫共沉淀的方法檢測(cè)了海馬腦片中Akt和Hsp90，Akt與蛋白磷酸酯酶-2A(proteinphosphatase-2A，PP-2A)的相互作用關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)小鼠器官型海馬腦片在培養(yǎng)

4、6hr時(shí)，LDH的釋放量達(dá)到最大，在培養(yǎng)的48hr后，LDH的釋放量趨于穩(wěn)定，并持續(xù)到72hr。(2)與對(duì)照組相比，MG132處理海馬腦片導(dǎo)致tau蛋白總量及tau-Thr205、Thr231和Ser396等位點(diǎn)磷酸化程度的增加，但同時(shí)tau-Ser214位點(diǎn)的磷酸化水平出現(xiàn)劑量依賴性下降。(3)抑制proteasome的活性降低了tau蛋白與微管的結(jié)合能力。(4)抑制proteasome的活性可導(dǎo)致Akt-Ser473和Thr308位

5、點(diǎn)以及GSK-3β-Ser9位點(diǎn)的磷酸化程度下降，但Akt和GSK-3β的總量不變。(5)在海馬腦片中，Akt與Hsp90和PP-2A的免疫共沉淀反應(yīng)呈陽(yáng)性，且抑制蛋白酶體的活性可導(dǎo)致Akt和Hsp90的免疫共沉淀反應(yīng)減弱，而Akt與PP-2A的免疫共沉淀反應(yīng)增強(qiáng)。
　　以上結(jié)果表明:微管相關(guān)蛋白tau是proteasome的底物，抑制proteasome的活性可導(dǎo)致tau蛋白降解障礙和總量增加，此外，抑制proteasome的活