蛋白酶體抑制劑對腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、腎間質(zhì)纖維化(RIF)是各種慢性腎臟病發(fā)展到終末期腎衰(ESRD)的共同途徑。它以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，如Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)、Ⅲ型膠原（Col Ⅲ）、纖維連接蛋白(FN)和層連蛋白在腎間質(zhì)過度的積聚及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增生為特征。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是一種重要的致腎間質(zhì)纖維化的細(xì)胞因子，它能與細(xì)胞膜上受體結(jié)合，并通過活化Smad蛋白、啟動相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄來促進(jìn)腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展。泛素-蛋白酶體通路主要作用為降解細(xì)胞內(nèi)蛋白

2、質(zhì)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)特殊蛋白的濃度。機(jī)體內(nèi)許多信號蛋白均通過蛋白酶體降解，因此蛋白酶體抑制劑可通過調(diào)控相關(guān)信號蛋白發(fā)揮其潛在的作用。 本課題以大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞(NRK-49F)為研究對象，采用Realtime PCR及Western blot等方法檢測相關(guān)信號蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)，EMSA檢測NF-kB活性來研究蛋白酶體抑制劑MG132對 TGF-β1致腎間質(zhì)纖維化作用的影響，以達(dá)到初步探討蛋白酶體抑制劑延緩腎間質(zhì)纖維化的潛在作

3、用和機(jī)制的目的。 本研究第一部分首先觀察MG132對TGF-β1刺激NRK-49F細(xì)胞表達(dá)纖維化相關(guān)蛋白的影響。研究發(fā)現(xiàn)MG132(0.5～5μmol/L) 可明顯降低細(xì)胞CTGF、α-SMA和FN、Col Ⅲ mRNA的基礎(chǔ)表達(dá)(與對照組相比，均p<0.05)。5ng/ml TGF-β1使CTGF、α-SMA和FN、Col Ⅲ mRNA表達(dá)增加，分別為對照組的6.91、2.11、1.38和3.60倍；MG132不同濃度(0.5

4、～5μmol/L)預(yù)處理0.5h后，CTGF、α-SMA、FN和Col Ⅲ mRNA表達(dá)及FN、α-SMA、ColⅠ和Col Ⅲ蛋白表達(dá)與5ng/ml TGF-β1單獨刺激組比較均呈不同程度的下降。進(jìn)一步觀察MG132對TGF-β1作用的時間效應(yīng)，結(jié)果顯示：MG132在多個時間點（6h，12h，24h）均能抑制TGF-β1所引起的纖維化相關(guān)因子mRNA表達(dá)的上調(diào)。表明MG132能以濃度和時間依賴方式降低纖維化相關(guān)因子的表達(dá)，在延緩腎間質(zhì)

5、纖維化方面有潛在的作用。 為進(jìn)一步探討MG132抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化的機(jī)制，本文觀察了MG132對TGF-β信號傳導(dǎo)通路的影響。應(yīng)用5ng/ml TGF-β1刺激NRK-49F不同時間，通過western blot方法檢測TGF-β通路中信號Smad磷酸化。然后在此時間基礎(chǔ)上，加用不同濃度MG132(0.5～5μmol/L)預(yù)處理，另設(shè)以對照組及5ng/ml TGF-β刺激組，觀察信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子及相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示

6、：5ng/ml TGF-β1可以時間依賴方式誘導(dǎo)p-Smad2、p-Smad3蛋白表達(dá)，1小時達(dá)到高峰。MG132預(yù)處理組與TGF-β1刺激組p-Smad2及p-Smad3蛋白相比顯著下降，各組總Smad2/3蛋白表達(dá)無顯著變化。TGF-β通路中的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白Smad7及SnoN在5ng/ml TGF-β1刺激1h后，與對照組相比均有上調(diào)趨勢；MG132預(yù)處理后，Smad7和 SnoN蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)。上述結(jié)果提示MG132可抑制TG

7、F-β/Smads通路發(fā)揮抗腎纖維化作用。 NF-kB信號通路是腎間質(zhì)纖維化的另一個重要機(jī)制，故我們同時觀察了MG132對NF-kB通路蛋白及NF-kB活性的影響。用不同濃度MG132(0.5～5μmol/L)預(yù)處理NRK-49F 0.5h，再加用5ng/ml TGF-β1刺激，另設(shè)以對照組及5ng/ml TGF-β1刺激組，結(jié)果表明：MG132能以濃度依賴方式上調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的NF-kB信號通路蛋白IκB、p-IκB表達(dá)及

8、抑制NF-kB活性。其中p-IkB表達(dá)經(jīng)5ng/ml TGF-β1刺激后為對照組的1.92倍，隨著MG132預(yù)處理濃度的增加，其蛋白表達(dá)分別為對照組的2.95、3.25、3.48、4.17倍。EMSA顯示低濃度MG132(0.5μmol/L) 預(yù)處理細(xì)胞即對NF-kB的活性有明顯的抑制作用。提示MG132可通過作用于NF-kB通路發(fā)揮其抗纖維化的潛在作用。 通過上述研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制MG132能夠通過抑制TGF-β及NF-k