骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與牙髓細(xì)胞共培養(yǎng)體系在牙髓再生中應(yīng)用研究.pdf

1、目的：體外建立骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs）與牙髓細(xì)胞（Dental Pulp Cells，DPCs）的共培養(yǎng)體系，觀察和評(píng)價(jià)兩種細(xì)胞在共培養(yǎng)后各自細(xì)胞特性的變化和相互影響，探索最佳的兩種細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中的細(xì)胞比例和培養(yǎng)時(shí)間，體內(nèi)評(píng)估該共培養(yǎng)體系培養(yǎng)后的細(xì)胞應(yīng)用于牙髓再生中的可行性，為牙髓再生種子細(xì)胞的選擇提供新思路及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、體

2、外分離、培養(yǎng)及鑒定BMMSCs和DPCs。將細(xì)胞在0.4μm的Transwell小室中進(jìn)行共培養(yǎng)，分組情況如下：①單一BMMSCs；②單一DPCs；③BMMSCs和DPCs共培養(yǎng)組。共培養(yǎng)6天后，用MTT法繪制以上各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線并分別提取RNA及蛋白，分別進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及蛋白免疫印跡（WB）檢測(cè)牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）、堿性磷酸酶（ALP）、基質(zhì)細(xì)胞抗原-1（Stro-1）和CD145的表達(dá)情況。
　　2、為探索

3、最佳的共培養(yǎng)細(xì)胞比例和體外共培養(yǎng)時(shí)間，將細(xì)胞在0.4μm的Transwell小室中進(jìn)行共培養(yǎng)，BMMSCs與DPCs按照10:1、1:1、1:5和1:10的比例分別共培養(yǎng)3、6、9、12天。提取以上各組細(xì)胞的mRNA，qPCR檢測(cè)DSPP、ALP、Stro-1和CD146的表達(dá)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3、將人牙牙根段的根管進(jìn)行機(jī)械及化學(xué)預(yù)備，將牙根段隨機(jī)分為4組，每組4個(gè)樣本，將不同的細(xì)胞成分在水凝膠支架中混勻，并注入根管內(nèi)，分組

4、情況如下：①BMMSCs組；②DPCs組；③共培養(yǎng)組；④水凝膠支架空白組。將以上制備好的牙根段，移植到裸鼠背部，6周后取出標(biāo)本，制作HE染色切片，并于顯微鏡下觀察組織生長(zhǎng)情況。
　　結(jié)果：
　　1、分離培養(yǎng)的SD大鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，24小時(shí)后可見細(xì)胞貼壁呈比較均一的圓球狀，3天后呈長(zhǎng)梭形、紡錘樣，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖分裂聚集呈簇似漩渦樣。流式細(xì)胞儀檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29,CD44表達(dá)陽性；造血干細(xì)胞標(biāo)記物C

5、D45，CD34表達(dá)陰性。用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基及成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)21天、21天和14天后，分別進(jìn)行茜素紅、油紅O及阿爾新藍(lán)染色陽性。牙髓細(xì)胞傳至第三代后形態(tài)均一，長(zhǎng)梭形，呈成纖維樣細(xì)胞形態(tài)。免疫組織化學(xué)染色提示，角蛋白染色陰性，而波形絲蛋白染色陽性，提示培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞為間充質(zhì)來源，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、通過共培養(yǎng)體系，可以提高BMMSCs牙髓細(xì)胞特異標(biāo)志物DSPP和ALP的表達(dá)，降低干細(xì)胞標(biāo)志物Stro-1和

6、CD146的表達(dá)，顯示有向牙髓細(xì)胞向分化的趨勢(shì)；同時(shí)也可以提高DP Cs干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，降低牙髓細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，提示有去分化的趨勢(shì)，激活分化為其它細(xì)胞的潛能。
　　3、共培養(yǎng)細(xì)胞比例與時(shí)間改變，會(huì)對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的分化情況有明顯影響。在BMMSCs與DPCs按照1：1與1:5的比例共培養(yǎng)時(shí)，可以較高效的誘導(dǎo)B MMSCs分化及DPCs表達(dá)干細(xì)胞特異標(biāo)記物；體外共培養(yǎng)條件下，BMMSCs牙髓細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)增加、干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)下降

7、在共培養(yǎng)9-12天增加更為明顯，DPCs干細(xì)胞標(biāo)記物在共培養(yǎng)6-9天增加明顯。
　　4、BMMSCs與DPCs按照1:1比例共培養(yǎng)9天，并裝配至多肽水凝膠支架充盈至經(jīng)機(jī)械化學(xué)預(yù)備后的根管內(nèi)，牙根段移植至裸鼠背部6周后，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組能再生組織結(jié)構(gòu)與正常牙髓相似的類牙髓組織，而單一細(xì)胞組再生組織量較少且組織結(jié)構(gòu)與正常牙髓差異較大。
　　結(jié)論：
　　1、在共培養(yǎng)體系中，BMMSCs與DPCs相互影響，增殖速率及mRNA、蛋白

8、的表達(dá)發(fā)生變化；BMMSCs受DPCs的影響出現(xiàn)牙髓細(xì)胞向分化的趨勢(shì)，D PCs出現(xiàn)去分化表現(xiàn)，結(jié)果提示共培養(yǎng)條件在一定程度可調(diào)控共培養(yǎng)細(xì)胞的增殖與分化，用低比例的DPCs獲得更多來源的適合牙髓組織再生的種子細(xì)胞。
　　2、在BMMSCs與DPCs共培養(yǎng)體系中，細(xì)胞共培養(yǎng)比例為1:1、1:5，體外共培養(yǎng)時(shí)間為9天左右時(shí)，細(xì)胞增殖與分化互相影響最為明顯。
　　3、體內(nèi)皮下異位實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，該共培養(yǎng)體系培養(yǎng)的細(xì)胞可以作為牙髓組